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研究背景和目的牙本质是牙齿的主体结构,它的形成是构建牙髓牙本质复合体和组织工程牙齿的关键。成牙本质细胞作为形成牙本质的唯一来源细胞,是人体一种比较特殊的终末分化细胞,在正常的牙齿发育过程中是由神经嵴来源的牙乳头细胞分化而来的,牙齿发育完成后,当受到深龋、磨损等刺激时,可由牙髓中的牙髓干细胞分化而来。无论在生理或病理情况下,成牙本质细胞均需通过分泌矿化基质、继而矿化形成牙本质。这一过程受到多种信号分子和转录因子的调控,显得尤为重要和复杂。因此,深入探讨成牙本质细胞的矿化机制、寻找矿化过程中的关键分子,不仅对构建生理性牙髓牙本质复合体具有重大意义,还将对构建组织工程牙齿具有极大的促进作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（The mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）是细胞感受营养、调节生长与代谢的中心信号分子。mTORC1可以调控干细胞的成骨、成脂、神经向分化等多向分化能力。国内外关于mTORC1与牙源性干细胞的报道较少,mTORC1大多作为下游信号通路参与调节牙源性干细胞的成骨成牙向分化,但成牙本质细胞中mTORC1的作用尚不清楚。同时,p53信号通路在牙齿的发育和牙髓干细胞成牙本质向分化发挥重要的作用。故本实验拟采用雷帕霉素及结节性硬化复合物1（tuberous sclerosis complex 1,TSC1）慢病毒体外抑制及激活小鼠成牙本质样细胞MDPC23中mTORC1活性、构建成牙本质细胞TSC1敲除鼠,明确mTORC1调控成牙本质细胞矿化等相关特性的作用,同时通过转录组测序筛选出p53信号通路,探究p53信号通路是否参与mTORC1对成牙本质细胞矿化能力的调控,为促进牙髓再生提供新的靶点及提供理论基础。材料与方法1.抑制mTORC1活性对MDPC23增殖及矿化能力的影响采用雷帕霉素抑制MDPC23中mTORC1活性,Western Blot筛选出有效的抑制浓度,流式细胞周期及CCK8细胞增殖实验检测抑制mTORC1活性对MDPC23细胞增殖能力的影响;采用qRT-PCR、Western Blot、茜素红及碱性磷酸酶染色等检测抑制mTORC 1活性对MDPC23矿化能力的影响。2.激活mTORC1活性对MDPC23增殖及矿化能力的影响构建抑制表达TSC1的慢病毒载体,转染MDPC23,激活mTORC1活性,qRT-PCR及Western Blot验证其对MDPC23中TSC1表达水平的影响。设置对照病毒组和TSC1慢病毒组,流式细胞周期及CCK8细胞增殖实验检测激活mTORCl活性对MDPC23细胞增殖能力的影响;采用qRT-PCR、Western Blot、茜素红及碱性磷酸酶染色等检测激活mTORC1活性对MDPC23矿化能力的影响。3.体内激活mTORC1活性对成牙本质细胞矿化能力的影响利用DPM1-Cre及TSC1flox/flox小鼠,构建成牙本质细胞TSC1敲除鼠,琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,取同窝出生同性别野生型小鼠及TSC1敲除鼠下颌磨牙,利用micro-CT、HE染色及免疫荧光检测激活mTORC1对1个月及3个月小鼠磨牙牙本质厚度及牙本质矿化程度的影响。4.p53信号通路在mTORC1调控成牙本质细胞矿化能力中的作用采用qRT-PCR及Western Blot验证抑制及激活mTORC1活性后p53基因及蛋白的表达,利用Western Blot筛选p53抑制剂的有效浓度;采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等检测抑制p53对MDPC23矿化能力的影响;采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等检测抑制mTORC1活性同时抑制p53对MDPC23细胞矿化能力的影响。结果1.抑制mTORC1活性对MDPC23增殖及矿化能力的影响Western Blot结果表明雷帕霉素刺激浓度为10nM时明显抑制MDPC23中S6蛋白的磷酸化,pS6表达下调,抑制mTORC1活性;CCK8及流式细胞周期检测结果显示,与对照组相比,雷帕霉素刺激组细胞增殖能力明显降低,处于分裂间期S期的细胞显著减少;qRT-PCR及Western Blot结果表明在雷帕霉素刺激下,抑制mTORC1活性,明显抑制MDPC23矿化相关基因（ALP、DSPP、COL1）及蛋白（ALP、COL1）的表达;碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果示,雷帕霉素刺激组细胞较对照组染色明显淡染,矿化结节形成显著减少。2.激活mTORC1活性对MDPC23增殖能力及矿化能力的影响qRT-PCR及Western Blot结果表明抑制表达TSC1的慢病毒有效抑制MDPC23中TSC1的表达。CCK8及流式细胞周期检测结果示,与对照组相比,TSC1慢病毒转染组细胞增殖能力显著增强,处于分裂间期S期的细胞明显增多;qRT-PCR及Western Blot结果表明TSC1慢病毒转染组细胞,激活mTORC1活性,明显促进MDPC23矿化相关基因（ALP、DSPP、COL1）及蛋白（ALP、COL1）的表达;碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果表明,TSC1慢病毒转染组细胞,碱性磷酸酶染色明显深染,矿化结节形成增多。3.体内激活mTORC1活性后对成牙本质细胞矿化能力的影响本实验成功构建成牙本质细胞TSC1敲除鼠。micro-CT结果表明,与野生型小鼠相比,1个月与3个月的敲除鼠磨牙牙本质厚度增厚,牙本质体积增加,HE染色结果与micro-CT结果一致;免疫荧光结果表明,与野生型小鼠相比,1个月与3个月的敲除鼠成牙本质细胞矿化相关蛋白表达增强。4.p53信号通路在mTORC1调控成牙本质细胞矿化能力中的作用qRT-PCR及Western Blot结果表明抑制及激活mTORC1活性后p53基因及蛋白相应的升高和降低;Western Blot结果表明p53抑制剂作用浓度为20μM时显著抑制MDPC23中p53蛋白的表达;qRT-PCR及Western Blot结果表明在p53抑制剂作用下,明显促进MDPC23矿化相关基因（ALP、DSPP、COL1）及蛋白（ALP、COL1）的表达;碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果示,抑制p53活性,细胞染色明显加深,矿化结节形成显著增多;qRT-PCR及Westem Blot结果表明抑制mTORC1活性同时抑制p53活性可拯救由于雷帕霉素引起的矿化相关基因（ALP、DSPP、COL1）及蛋白（ALP、COL1）的下降;碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果示,抑制mTORC1活性同时抑制p53活性可拯救由于雷帕霉素引起的碱性磷酸酶活性降低以及矿化结节形成减少。结论1.1 0nM雷帕霉素可有效抑制MDPC23中mTORC 1活性。抑制MDCP23的mTORC1活性能显著降低MDPC23的增殖及矿化能力。2.抑制TSC1的慢病毒载体可有效抑制MDPC23中TSC1的表达水平。TSC1抑制表达慢病病毒可显著激活mTORC1活性,增强MDPC23增殖及矿化能力。3.本实验成功构建成牙本质细胞条件敲除TSC1条件基因敲除鼠。体内激活成牙本质细胞的mTORC1活性,能显著促进矿化相关蛋白的表达,促进牙本质形成。4.mTORC1通过p53相关信号通路调控成牙本质细胞的矿化能力。