骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤。约80%-90%的骨肉瘤发生在长管状骨干骺端,尤其是肱骨近端、股骨远端和胫骨近端。1970年以前,对于无转移的骨肉瘤一般采取截肢手术治疗,其5年生存率不足20%,随着新辅助化疗的应用和手术技术的提高,患者生存率得到明显改善。目前,骨肉瘤患者3年无瘤生存率已上升到60-70%,5年无瘤生存率和5年生存率分别为57%和66%,10年无瘤生存率和10年生存率分别为52%和57%。30多年来,随着手术及化疗水平的逐步提高,局限性骨肉瘤患者的长期生存率已经高达70%,但合并肺部转移患者的5年生存率却没有明显提高,仍然低于30%,肺部转移是导致骨肉瘤患者死亡的主要原因。约有20%的患者在骨肉瘤确诊的时候,就已经发现有肺部转移。其余确诊时未发现肺部转移的骨肉瘤患者中,约有20～50%在治疗期间或治疗结束后也会发生肺部转移。因此预防及早期诊断骨肉瘤的肺部转移是目前提高骨肉瘤疗效的关键。骨桥蛋白(OPN)是一种分泌型黏合糖蛋白,分子量为44 kDa,分子中心有一个特殊的RGD序列(Arg-Gly-Asp),是首次发现在骨组织中的一种唾液酸糖蛋白,随后发现在肾脏、脑、巨噬细胞、血管平滑肌细胞和很多上皮细胞中都有表达。OPN能通过特定的信号通路参与细胞的黏附、迁移等生物学行为的调节。近些年发现OPN与恶性肿瘤的侵袭、转移及增殖等多种病理过程密切相关。1.研究目的本研究通过构建骨肉瘤肺转移小鼠模型,检测OPN在骨肉瘤原位瘤和肺转移瘤中表达水平的差异。通过OPN特异性siRNA质粒抑制OPN表达,检测OPN抑制后细胞的体外侵袭力。2.研究方法2.1体内验证OPN蛋白在骨肉瘤原位瘤和肺转移瘤中表达水平的差异。用luciferase荧光基因转染骨肉瘤细胞K7M2细胞株,用动物活体成像仪检测转染强度,G418进行筛选,CCK-8评价转染后细胞活性。将转染后的K7M2细胞配制成5x108/ml细胞悬液,50ul细胞悬液经右侧膝关节注射到balb/c小鼠的胫骨髓腔,注射后用动物活体成像仪观察肿瘤的生长情况及肺转移情况。待检测到肺肿瘤信号(注射后8周)后继续观察4周。处死小鼠,收集肺组织中较大的肿瘤灶,原代培养骨肉瘤细胞,再次重复以上实验1次,获得具有高转移潜能的骨肉瘤细胞。传三代后再次转染荧光基因,转染后继续传代培养。待细胞数足够多时配制成5x108/ml细胞悬液,将50ul的悬液注入小鼠胫骨髓腔。每3天检测肿瘤原位成瘤及肺转移情况。待小鼠明显消瘦呈恶病质(约注射后6周)可检测到瘤体和肺转移的荧光信号,继续观察4周后,处死小鼠,收集胫骨原位瘤、肺转移病灶和正常骨组织。采用western blot在蛋白质水平验证OPN在骨肉瘤原位瘤和肺转移瘤中表达水平的差异。通过免疫组织化学染色技术验证原位瘤和肺转移瘤中OPN蛋白表达差异。2.2 OPN蛋白功能的体外验证。体外合成OPN基因的特异性siRNA1、2、3和非特异性siRNA(ns siRNA), Lipofectamine2000介导转染到骨肉瘤细胞中,半定量RT-PCR检测siRNAs转染后细胞OPN的表达效能。细胞Transwell侵袭实验和划痕实验检测OPN表达抑制后细胞的体外侵袭力。3.研究结果生物转染luciferase荧光基因后,骨肉瘤细胞K7M2可稳定表达荧光基因,且不影响其活性。western blot验证OPN蛋白在骨肉瘤肺转移瘤中表达是胫骨原位瘤的1.67倍,差异有统计学意义(p<0.0001)。免疫组织化学染色结果与western blot结果一致。RT-PCR检测siRNA1、2、3转染后细胞OPN表达较nssiRNA转然后低,其中siRNA2抑制最明显,差异有统计学意义(p<0.0001)。细胞Transwell侵袭实验显示siRNA2组细胞透过孔径为8uM的隔膜的数量较对照组(未抑制)少。划痕实验亦提示OPN抑制组细胞爬向划痕中心的数量较对照组(未抑制)明显减少。4.结论(1)OPN蛋白在骨肉瘤肺转移瘤中表达明显高于胫骨原位瘤灶；(2)OPN蛋白表达水平与骨肉瘤细胞的侵袭性成正相关。