论文部分内容阅读
背景肺动脉高压是一处理极为棘手,高致死率和致残率的病理生理综合征,被认为是“假恶性”肿瘤。肺动脉高压与细胞内膜运输障碍有关。本研究旨在探讨膜运输相关蛋白在肺动脉高压发病过程中的作用。方法选用Sprague-Dawley大鼠经腹腔注射野百合碱建立肺动脉高压动物模型;用吡咯野百合碱处理人肺动脉内皮细胞建立肺动脉高压细胞模型;并在人肺动脉内皮细胞中采用Nem干预Nsf蛋白的活性。采用反转录——实时定量PCR和Western杂交技术检测了膜运输相关蛋白Nsf,α-Snap、Snap23和Syntaxin4以及内皮型一氧化氮合酶、小凹蛋白1和骨形成蛋白受体2在动物模型和细胞模型中的mRNA和蛋白表达变化。Western杂交检测凋亡相关蛋白在肺动脉高压动物模型、细胞模型和NEM干预后细胞内的表达变化,从而检测细胞凋亡的情况。结果在体内实验水平,与同步对照相比,实验组大鼠腹腔注射野百合碱后,Nsf,α-Snap、Snap23和Syntaxin4的mRNA表达呈先增高后降低的趋势。Nsf、α-Snap和Snap23在刺激1天后显著增高,α-Snap从刺激后7天开始下降,Nsf和Snap23于14天开始下降,表达量极少。Syntaxin4的mRNA表达在刺激2天后显著增高,14天和21天后基本检测不到。Western杂交显示随着实验动物肺动脉高压的形成,Nsf、α-Snap、SNAP23和Syntaxin4的蛋白表达亦出现先显著增高,后明显降低,甚至检测不到表达的变化趋势,与mRNA的表达变化趋势基本一致。内皮型一氧化氮合酶于大鼠腹腔注射野百合碱7天后mRNA表达显著增高,14天后下降,21天时基本检测不到。小凹蛋白1和骨形成蛋白受体2的表达从14天开始显著减少,21天时检测到极少量表达;Western杂交显示内皮型一氧化氮合酶、小凹蛋白1和骨形成蛋白受体2在野百合碱刺激14天后显著减少。在体外实验水平,α-Snap和Snap23的mRNA表达在吡咯野百合碱刺激4-8h内无明显变化,12-72h之间增加;Nsf、Syntaxin4和小凹蛋白1的mRNA表达与对照相比无显著变化;而内皮型一氧化氮合酶的mRNA表达在吡咯野百合碱刺激24-72h内显著增加;骨形成蛋白受体2的mRNA表达早期无显著变化,12-24h后显著增加,48h后降至正常水平。Western杂交检测结果显示Nsf、内皮型一氧化氮合酶和小凹蛋白1在吡咯野百合碱刺激后期减少;α-Snap从12h开始轻度增加。骨形成蛋白受体2先增加,后降低,甚至检测不到表达。用NEM处理人肺动脉内皮细胞后,Nsf的mRNA表达随刺激时间延长显著增高达40倍以上;α-Snap、Snap23和Syntaxin4的mRNA表达亦显著增高2-16倍。内皮型一氧化氮合酶和小凹蛋白1的mRNA表达呈先增高后降低的趋势。骨形成蛋白受体2的表达显著增高。Western杂交检测结果显示,与对照相比,Nsf、α-Snap、Syntaxin4和内皮型一氧化氮合酶的蛋白表达呈逐渐降低的趋势;Snap23的蛋白表达随Nem处理时间的延长先增高,后降低;小凹蛋白1的表达无明显变化;骨形成蛋白受体2蛋白表达在NEM处理48h后增加。在肺动脉高压的动物模型、细胞模型和用NEM处理后的人肺动脉内皮细胞中,Western杂交检测显示,procaspase-3表达下降,Fas或Bax表达增加,提示细胞凋亡增加。结论膜运输相关蛋白和内皮型一氧化氮合酶、小凹蛋白1以及骨形成蛋白受体2参与了肺动脉高压的病理生理过程。膜运输相关蛋白的表达水平在肺动脉高压形成过程中最先发生变化,膜运输障碍机制在肺动脉高压的发生和发展过程中发挥了重要作用。