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研究背景和目的槲皮素是富含于果蔬中的黄酮类化合物,因抗氧化和促凋亡作用在脑保护和抗肿瘤方面受到重视。槲皮素虽被视为膳食抗氧化剂,但近来发现其众多的生物学作用与其对金属的结合能力有关(铁、铜、锌等)。由于二价金属离子参与构成细胞内众多的蛋白质,且金属离子多位于蛋白质的活性部位,因此槲皮素能影响众多蛋白质的生理生化功能,导致应用疾病谱广泛、涉及体内各器官系统且靶点众多,是极具潜力的多靶点治疗工具。目前缺血性中风的防治因以神经元为中心的治疗策略的失败而提出了“神经血管单元”的概念,强调神经元、神经胶质细胞和脑血管微环境内的多靶点干预的重要性,这为槲皮素的脑保护作用提供了基本切入点。星形胶质细胞作为“神经血管单元”中重要的组成,星形胶质细胞的活化在脑缺血中呈现促进神经元存活与加重缺血性损伤的双重作用。此外,槲皮素似越过与抗氧化作用有关的模体而连到特殊的结构模体而发挥神经保护作用,其抗氧化作用以外的脑保护机制有待阐明。本文以银杏叶槲皮素为研究对象,探讨银杏叶单体化合物槲皮素预处理对谷氨酸-甘氨酸诱导的星形胶质细胞兴奋毒损伤的保护作用,旨在从预防性应用的角度,深入研究槲皮素对谷氨酸-甘氨酸诱导的星形胶质细胞兴奋毒损伤的预保护作用及其机制,为银杏叶单体化合物槲皮素的应用提供必要的参考。另外对银杏提取物单体成分之一槲皮素的脑保护机制的解析有助于解释临床和民间对银杏叶药物应用中的矛盾。实验方法培养新生24h大鼠原代大脑皮质星形胶质细胞,以胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)为标记鉴定星形胶质细胞;用MTT法检测细胞的生存活性;透射电镜观察星形胶质的细胞超微结构;用共聚焦显微镜观测槲皮素对星形胶质细胞内钙离子的影响;细胞免疫组化法和细胞免疫荧光法观察GFAP的表达和形态变化。结果1、槲皮素在12.5~100μmol/L浓度范围内对新生大鼠正常大脑皮质星形胶质细胞的生存活性较对照组未见差异。槲皮素预处理浓度在12.5~50μmol/L可明显提高谷氨酸-甘氨酸(Gly-Glu,G-G)诱导的兴奋毒损伤星形胶质细胞的生存活性(P<0.05),75~100μmol/L浓度组对星形胶质细胞的生存活性未见明显保护作用。2、细胞免疫组化实验发现槲皮素给药组GFAP的表达较G-G模型组减少,模型组星形胶质细胞GFAP高表达。3、细胞免疫荧光实验进一步证实,槲皮素给药组GFAP表达低于G-G模型组,正常组星形胶质细胞GFAP成网状分布,密度均匀。G-G模型组星形胶质细胞形态回缩,GFAP分布散乱,槲皮素预处理组星形胶质细胞的损伤少,GFAP变化情况较G-G模型组轻,趋向于恢复正常。4、用激光扫描共聚焦显微镜检测发现,槲皮素预处理组较G-G模型组钙离子激活明显减少,细胞内钙离子浓度升高较G-G模型组低,且之后会有明显下降趋势。5、透射电镜观察各组星形胶质细胞的超微结构,发现槲皮素预处理组线粒体形态正常,而G-G模型组的线粒体形态不规则,部分线粒体肿胀成球形,嵴碎裂交错,甚至模糊不清,槲皮素预处理组,线粒体形态正常,未见肿胀,嵴清晰可见。结论银杏叶槲皮素预防性给药能有效保护星形胶质细胞抗兴奋毒性损伤,这可能与其减少胞内钙浓度,降低星形胶质细胞的活化,稳定线粒体活动有关。