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目的:研究干扰素(interferon-alpha-2b,IFN-α2b)对骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasm,MPN)患者JAK2激酶(JAK2 kinase)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及微血管密度(microvessel density,MVD)的影响;并观察体外应用IFN-α2b对JAK2V617F突变阳性的人红白血病HEL细胞JAK2、COX-2的影响。探讨IFN-α2b对HEL细胞是否存在抑制增殖、迁移,诱导凋亡以及抑制JAK2、COX-2基因表达的作用,并探讨其体外作用机制,为IFN-α2b应用于临床治疗骨髓增殖性肿瘤提供理论依据。方法:1收集2012年01月至2014年10月在保定市第一医院门诊或住院接受荧光定量PCR检测确定有JAK2V617F阳性的MPN患者42例,其诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[1]。其中原发性血小板增多症(ET)17例,真性红细胞增多症(PV)10例,原发性骨髓纤维化(PMF)15例;42例MPN患者按照治疗方案分为初治组25例,经IFN-α2b治疗组17例;另收集同期10例特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic immune thrombocytopenic purpura,ITP)患者作为对照组。所有对象均签署知情同意书。2治疗方案对照组:因ITP患者不存在JAK2V617F突变,且病理组织的p-JAK2、COX-2水平及MVD与正常人相同,故此次实验选用ITP患者作为对照组。初治组:初次确诊还未接受治疗的JAK2V617F突变的MPN患者治疗组:IFN-α2b治疗组所有MPN患者均应用接受IFN-α2b(与本次细胞实验中IFN-α2b同厂家不同批次)皮下或肌肉注射,300万单位/次,3-7次/周,至少应用治疗6个月以上,根据白细胞、血红蛋白及血小板数量来决定是否联合应用羟基脲。3细胞实验分组选用jak2v617f突变阳性人红白血病细胞株(hel)。实验分为:对照组、ifn-α2b处理组。对照组仅用含10%新生牛血清的rpmi1640培养基培养。ifn-α2b处理组用含不同浓度ifn-α2b的10%新生牛血清rpmi1640培养基培养。ifn-α2b的终浓度分别为0.5×104u/l、1×104u/l、3×104u/l、5×104u/l。4应用荧光定量聚合酶链反应(fq-pcr)检测mpn患者jak2v617f突变量。5采用免疫组化检测患者骨髓病理组织p-jak2、cox-2的表达及cd105标记的微血管密度(mvd)。6采用cellcountingkit(cck-8)方法,观察ifn-α2b对hel细胞增殖抑制情况。7采用流式细胞技术观察ifn-α2b对hel细胞凋亡的影响。8采用transwell小室实验观察ifn-α2b对hel细胞迁移的影响9采用半定量pcr方法检测ifn-α2b作用于hel细胞后,各组细胞jak2、cox-2mrna的表达情况。10采用蛋白印迹(westernblot)技术检测ifn-α2b作用于hel细胞后,各组细胞p-jak2、cox-2蛋白的表达情况。11所有数据资料以均数±标准差(x±s)表示。采用spss19.0统计软件统计处理。两样本均数比较采用t检验,多组均数比较采用方差分析,组间两两比较选用q检验。p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1免疫组织化学检测结果显示:p-jak2、cox-2在初治组患者中表达水平分别为(82.41±11.65)%、(65.66±20.15)%,ifn-α2b治疗组患者表达水平(60.93±20.57)%、(44.30±12.83)%均明显的高于对照组患者表达水平(43.05±4.59)%、(28.69±3.75)%(p<0.05)。初治组的mvd为(26.58±5.93)/hp,ifn-α2b治疗组的mvd为(15.86±4.27)/hp,均明显高于对照组的mvd(10.76±4.01)/hp(p<0.05)。ifn-α2b可明显降低mpn患者p-jak2、cox-2及mvd表达水平。2应用荧光定量聚合酶链反应(fq-pcr)检测mpn患者jak2v617f突变量在26.8%-75.4%之间。将初治组分为jak2v617f/jak2<50%及≥50%两组,结果显示:jak2v617f/jak2≥50%组微血管数/hp、p-jak2+细胞比例、cox-2+细胞比例分别为(34.19±6.57)/hp,(89.76±20.56)%,(69.31±25.46)%,明显高于jak2v617f/jak2<50%的患者(19.16±5.34)/hp,(65.15±17.59)%,(44.72±18.41)%(p<0.05)。3cck-8结果显示:不同浓度(0.5×104u/l、1×104u/l、3×104u/l、5×104u/l)ifn-α2b处理组hel细胞的抑制率,24h时分别为(1.33±0.13)%、(2.18±0.16)%、(7.42±0.79)%、(12.56±1.07)%;48h时分别为(9.43±0.815)%、(15.20±1.94)%、(30.15±9.29)%、(51.60±7.18)%;72h时分别为(17.47±1.58)%、(29.39±3.12)%、(54.26±5.01)%、(79.15±8.17)%。与空白对照组相比,不同浓度ifn-α2b在作用hel细胞24h内细胞增殖抑制率无明显差异,p>0.05,48h、72h时hel细胞的增殖均明显受到抑制,差别有统计学意义(p<0.05)。并且随着ifn-α2b作用时间的延长以及药物剂量的增加,抑制率也逐渐升高(p<0.05)。4流式细胞术结果显示:不同浓度(0.5×104u/l、1×104u/l、3×104u/l、5×104u/l)ifn-α2b作用于hel细胞48h后,对照组细胞的凋亡率为(0.51±0.05)%,实验组各组细胞凋亡率分别为(1.76±0.25)%,(2.51±0.39)%,(15.02±1.29)%,(20.71±2.54)%。与对照组相比,ifn-α2b处理组hel细胞的凋亡率明显增加,差别均有统计学意义(p<0.05)。随着ifn-α2b浓度的增加,hel细胞凋亡率随之上升(p<0.05)。5transwell小室迁移实验结果显示:应用0.5×104u/l浓度的ifn-α2b处理hel细胞,24h后显微镜下观察漏出至下室细胞数目为(52.93±7.51)明显低于对照组(77.39±6.140)(p<0.05)。(cck-8结果显示低浓度ifn-α2b作用于hel细胞后24h对hel细胞无明显增殖抑制作用,故选用0.5×104u/l浓度的ifn-α2b)6半定量pcr检测显示:ifn-α2b作用于hel细胞48h后,对照组和不同浓度ifn-α2b(0.5×104u/l、1×104u/l、3×104u/l、5×104u/l)处理组hel细胞jak2mrna相对表达水平(条带相对灰度)分别为(1.354±0.099)、(1.271±0.103)、(0.857±0.091)、(0.443±0.212)、(0.232±0.176)。cox-2mrna相对表达水平(条带相对灰度)分别为(1.552±0.122)、(1.424±0.193)、(0.912±0.075)、(0.343±0.022)、(0.109±0.016)。β-actin mRNA表达水平在各组中无明显差异。与对照组相比较,IFN-α2b处理HEL细胞系48h后JAK2及COX-2的mRNA表达均明显降低(P<0.05),并随IFN-α2b的浓度增加而进行性减低。差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示,IFN-α2b能下调HEL细胞中JAK2、COX-2 mRNA的表达水平。7 Western blot检测显示:IFN-α2b作用于HEL细胞48h后,空白对照组和不同浓度IFN-α2b(0.5×104U/L、1×104U/L、3×104U/L、5×104U/L)处理组HEL细胞p-JAK2蛋白相对表达水平(条带相对灰度)分别为(2.504±0.256)、(2.551±0.219)、(1.857±0.159)、(1.032±0.127)、(0.703±0.076)。COX-2蛋白条带相对灰度分别为(1.241±0.109)、(1.301±0.153)、(0.809±0.063)、(0.351±0.045)、(0.139±0.022)。β-actin蛋白表达水平在各组中无明显差异。IFN-α2b处理组与空白对照组相比p-JAK2、COX-2蛋白的表达均受到抑制(P<0.05)。且随着药物浓度的增加,2种蛋白表达量有减少趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示,IFN-α2b能下调HEL细胞中p-JAK2、COX-2蛋白的表达水平。结论:1 JAK2V617F阳性的初治组MPN患者p-JAK2、COX-2表达水平及MVD均高于对照组及治疗组,IFN-α2b可明显降低MPN患者p-JAK2、COX-2及MVD表达水平。2体外应用IFN-α2b具有明显抑制HEL细胞增殖,诱导其凋亡的作用,并随着IFN-α2b浓度的增加HEL细胞增殖抑制率及凋亡率逐渐升高。3体外应用IFN-α2b对HEL细胞迁移有明显抑制作用。4体外应用IFN-α2b能下调HEL细胞JAK2、COX-2 mRNA及其p-JAK2、COX-2蛋白的表达水平,并随IFN-α2b的浓度增加而进行性减低。