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目的：
1.构建柚皮苷/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Naringin/Gelatinmicrospheres/Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin，NG/GMs/nHA/SF)复合支架材料，并表征该支架材料的物化性质、药物缓释性能、体外降解性能及生物力学性能。
2.评估NG/GMs/nHA/SF复合支架对骨髓间充质干细胞(Bone Marrow MesenchymalStem Cells, BMSCs)增殖及成骨分化的诱导效应，并探讨初步机制。
3.评估NG/GMs/nHA/SF复合支架修复骨质疏松椎体骨折(Osteoporoticvertebral fracture, OVF)骨缺损的效果，并探讨相关机制。
方法：
1.材料制备及表征：运用冷冻干燥法制备丝素蛋白(Silk Fibroin, SF)、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin, nHA/SF)、柚皮苷/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Naringin/Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin, NG/nHA/SF)及NG/GMs/nHA/SF支架，通过扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)扫描材料内部结构，通过药物释放实验检测负载柚皮苷(Naringin, NG)的药物释放情况，通过降解实验检测支架材料的体外生物降解性能，通过压缩实验检测支架材料的生物力学性能。
2.体外研究(细胞实验)：
(1)支架材料对BMSCs增殖及成骨分化作用：提取2周龄(Sprague Dawley， SD)大鼠BMSCs，培养后运用流式技术进行干细胞类型鉴定。将SF、nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF支架与BMSCs共育，通过CCK8检测材料对BMSCs增殖的影响；通过成骨诱导分化后行ALP染色、茜素红染色及AKP活性检测以评估材料对BMSCs成骨分化的诱导效应；
(2)初步探讨支架材料在诱导BMSCs成骨分化过程中对BMP-2、Runx2、OCN的调控作用：通过Rt-qPCR、Wersternblot检测材料干预BMSCs后不同时间点BMP-2、Runx2、OCNmRNA及蛋白表达以探究材料诱导BMSCs成骨分化的初步机制。
3.体内研究(动物实验)：
(1)大鼠OVF骨缺损模型的构建及评估：选取30只6周龄的雌性SD大鼠，6只作为正常对照，其余24只大鼠按经典骨质疏松(Osteoporosis, OP)成模方法予去双侧卵巢处理，12周后在SD大鼠腰6椎体构建大小约3mm×3mm×3mm的骨缺损以构建OVF骨缺损模型，并在造模后4、8、12、16周取L6伤椎行X线、micro-CT、HE染色、番红固绿染色检测评估OVF骨缺损模型骨缺损愈合的情况；
(2)支架材料对SD大鼠OVF骨缺损的修复作用：选取115只6周龄SD大鼠按照前述方法进行OVF骨缺损模型造模，将大鼠分为5组，分别为模型组、SF组、nHA/SF组、NG/nHA/SF组、NG/GMs/nHA/SF组，每组23只。各组大鼠OVF骨缺损模型构建成功后，将各支架材料植入骨缺损内，在材料植入4周(M1)、8周(M2)、12周(M3)、16周(M4)时取材(M1、M2、M3取材5只，M4取材8只)，检测指标：①伤椎大体观：通过肉眼观察伤椎骨缺损愈合大体情况，并拍照；②X线检测：取材前将大鼠麻醉并通过X光机进行伤椎扫描；③micro-CT:分离L6伤椎，行micro-CT扫描,划定椎体感兴趣区域后进行三维重建;④苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin， HE)染色、番红固绿染色、Masson染色：上述伤椎micro-CT扫描后用甲醛固定,进行脱钙、脱水、包埋、切片处理,HE染色检测伤椎内骨组织形态学变化，番红固绿染色判断骨缺损局部骨及软骨形成情况，Masson染色判断骨缺损处胶原形成情况；通过以上检测观察不同的SF支架复合材料对OVF骨缺损的修复作用；
(3)支架材料对OVF大鼠骨缺损伤椎成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用：①免疫荧光检测OVF大鼠L6伤椎BMP-2、Runx2、Osteocalcin、VEGFA、CTSK、CollagenII、IL-6、NF-кB、TNF-α蛋白表达情况；②WersternBlot检测OVF大鼠L6伤椎BMP-2、Runx2、Osteocalcin、VEGFA、CTSK、CollagenII、IL-6、NF-KB、TNF-α蛋白表达情况；
(4)支架材料对OVF大鼠血清雌激素水平、AKP活性及CTSK水平的影响：①取上述(2)中实验大鼠进行腹主动脉采血,离心获取血清,碱性磷酸酶测试盒检测M1、M2、M3、M4时间点血清AKP活性;②ELISA检测上述①中各时间点血清雌激素(Estrogen)、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)水平。
结果：
1.材料制备及表征结果：
(1)材料基本特征：我们通过冷冻干燥法成功制备了NG/GMs/nHA/SF复合支架，作为对照，我们还制备了SF、nHA/SF、NG/nHA/SF支架。随着不同材料的加入，支架的孔隙率有所下降。NG/GMs/nHA/SF支架孔隙率接近70%，为67.56±1.39%。在扫描电镜下，材料呈多孔结构。
(2)材料药物缓释性能：NG/nHA/SF支架材料可见突释效应，6h时释放了约50%，24h时释放了约80%，48h时释放了约90%。NG/GMs/nHA/SF复合支架可大大降低NG的突释效应，6h时释放小于35%，12h时释放小于50%，12h后可持续稳定缓释，至144h时，释放约90%。
(3)材料体外降解性能：含酶情况下，各材料降解较快，10d时nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF降解约80%，而无酶情况下，降解约60%。SF支架降解较慢，在含酶状态下10d时降解约60%，无酶状态下降解40%左右。
(4)材料生物力学性能：nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF复合支架压缩应力和压缩强度显著高于SF支架组(P＜0.05，P＜0.01)，且NG/GMs/nHA/SF支架具有最佳的力学性能。
2.细胞实验结果：
(1)BMSCs培养及流式鉴定结果：从2周龄雄性SD大鼠提取的BMSCs经过培养后显示出原代BMSCs形态(P0)，镜下P0代细胞可见到克隆球，且BMSCs呈梭形。通过流式鉴定，可见CD44、CD29、CD90(BMSCs阳性标志物)表达率分别为90.6%、91.5%、92.8%，CD34、CD45、CD11b/c(BMSCs阴性标志物)表达率分别为5.5%、3.3%、3.6%；
(2)支架材料对BMSCs增殖、成骨分化作用：①增殖作用：CCK8检测发现，与Control组相比，SF、nHA/SF、NG/nHA/SF和NG/GMs/nHA/SF复合支架材料体外均可促BMSCs增殖(P?0.05)，NG/GMs/nHA/SF复合支架材料效果最佳；②成骨分化作用：各材料与BMSCs共育3、7、10、14d后发现各材料组ALP、茜素红阳性染色及AKP活性逐渐增加，且NG/GMs/nHA/SF组效果最佳；
(3)支架材料对BMP-2、Runx2、OCN表达水平的影响：不同时间段，BMP-2、Runx2、OCNmRNA和蛋白表达在SF、nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF支架组呈现增加趋势，且NG/GMs/nHA/SF支架组表达水平最高。
3.动物实验结果：
(1)大鼠OVF骨缺损模型的构建及评估结果：造模16周后，SD大鼠OVF模型L6椎体骨缺损未见明显自然愈合；
(2)支架材料对SD大鼠OVF骨缺损修复的作用：①肉眼观：材料植入4、8、12、16周后伤椎外观显示，NG/GMs/nHA/SF支架植入组新生骨组织较其他组多；②X线结果：NG/GMs/nHA/SF在不同时间点相比其他组愈合更佳；③micro-CT结果：micro-CT三维重建分析提示NG/GMs/nHA/SF在不同时间点相比其他组有更多的新骨生成，BV/TV、BMD也显著高于其余四组(P＜0.05)；④HE、番红固绿、Masson染色结果：HE染色提示NG/GMs/nHA/SF在不同时间点与其他组相比，具有更多的骨细胞、成骨细胞；番红固绿染色提示NG/GMs/nHA/SF组骨形成多余其余组；Masson染色提示NG/GMs/nHA/SF组相对于其他组有更多的胶原形成。以上结果共同证实了NG/GMs/nHA/SF复合支架可显著促进OVF愈合，且疗效较SF、nHA/SF、NG/nHA/SF组更满意；
(3)支架材料对OVF大鼠椎体成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用：①免疫荧光结果：在大多数时间点，NG/GMs/nHA/SF组BMP-2、Runx2、Osteocalcin、Collagen2、VEGFA、CTSK荧光表达强于其它组，IL-6、NF-кB、TNFR2表达低于其他组；②WB结果：在M4时间点，NG/GMs/nHA/SF组BMP-2、Runx2、OCN、Collagen2、VEGFA、CTSK蛋白表达高于其它组(P＜0.05)，IL-6、NF-кB、TNFR2蛋白表达低于其他组(P＜0.05)；
(4)支架材料对OVF大鼠血清雌激素水平、AKP活性及CTSK水平的影响结果：在大部分时间点，NG/GMs/nHA/SF复合支架组血清AKP活性、血清雌激素(Estrogen)显著高于其他四组(P＜0.05)，而CTSK水平低于其他组(P＜0.05)。
结论：
1.所制备的NG/GMs/nHA/SF复合支架是一种多孔材料，该材料可持续缓慢释放柚皮苷，且其具有良好的生物相容性、力学性能、生物可降解及骨诱导性能。
2.NG/GMs/nHA/SF复合支架材料可促进BMSCs增殖及成骨分化，其机制可能与上调BMP-2、Runx2、OCN的表达相关。
3.NG/GMs/nHA/SF复合支架材料可促进OVF大鼠伤椎骨缺损修复，其作用可能与该支架材料对成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用密切相关。
1.构建柚皮苷/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Naringin/Gelatinmicrospheres/Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin，NG/GMs/nHA/SF)复合支架材料，并表征该支架材料的物化性质、药物缓释性能、体外降解性能及生物力学性能。
2.评估NG/GMs/nHA/SF复合支架对骨髓间充质干细胞(Bone Marrow MesenchymalStem Cells, BMSCs)增殖及成骨分化的诱导效应，并探讨初步机制。
3.评估NG/GMs/nHA/SF复合支架修复骨质疏松椎体骨折(Osteoporoticvertebral fracture, OVF)骨缺损的效果，并探讨相关机制。
方法：
1.材料制备及表征：运用冷冻干燥法制备丝素蛋白(Silk Fibroin, SF)、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin, nHA/SF)、柚皮苷/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白(Naringin/Nano-hydroxyapatite/Silk Fibroin, NG/nHA/SF)及NG/GMs/nHA/SF支架，通过扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)扫描材料内部结构，通过药物释放实验检测负载柚皮苷(Naringin, NG)的药物释放情况，通过降解实验检测支架材料的体外生物降解性能，通过压缩实验检测支架材料的生物力学性能。
2.体外研究(细胞实验)：
(1)支架材料对BMSCs增殖及成骨分化作用：提取2周龄(Sprague Dawley， SD)大鼠BMSCs，培养后运用流式技术进行干细胞类型鉴定。将SF、nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF支架与BMSCs共育，通过CCK8检测材料对BMSCs增殖的影响；通过成骨诱导分化后行ALP染色、茜素红染色及AKP活性检测以评估材料对BMSCs成骨分化的诱导效应；
(2)初步探讨支架材料在诱导BMSCs成骨分化过程中对BMP-2、Runx2、OCN的调控作用：通过Rt-qPCR、Wersternblot检测材料干预BMSCs后不同时间点BMP-2、Runx2、OCNmRNA及蛋白表达以探究材料诱导BMSCs成骨分化的初步机制。
3.体内研究(动物实验)：
(1)大鼠OVF骨缺损模型的构建及评估：选取30只6周龄的雌性SD大鼠，6只作为正常对照，其余24只大鼠按经典骨质疏松(Osteoporosis, OP)成模方法予去双侧卵巢处理，12周后在SD大鼠腰6椎体构建大小约3mm×3mm×3mm的骨缺损以构建OVF骨缺损模型，并在造模后4、8、12、16周取L6伤椎行X线、micro-CT、HE染色、番红固绿染色检测评估OVF骨缺损模型骨缺损愈合的情况；
(2)支架材料对SD大鼠OVF骨缺损的修复作用：选取115只6周龄SD大鼠按照前述方法进行OVF骨缺损模型造模，将大鼠分为5组，分别为模型组、SF组、nHA/SF组、NG/nHA/SF组、NG/GMs/nHA/SF组，每组23只。各组大鼠OVF骨缺损模型构建成功后，将各支架材料植入骨缺损内，在材料植入4周(M1)、8周(M2)、12周(M3)、16周(M4)时取材(M1、M2、M3取材5只，M4取材8只)，检测指标：①伤椎大体观：通过肉眼观察伤椎骨缺损愈合大体情况，并拍照；②X线检测：取材前将大鼠麻醉并通过X光机进行伤椎扫描；③micro-CT:分离L6伤椎，行micro-CT扫描,划定椎体感兴趣区域后进行三维重建;④苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin， HE)染色、番红固绿染色、Masson染色：上述伤椎micro-CT扫描后用甲醛固定,进行脱钙、脱水、包埋、切片处理,HE染色检测伤椎内骨组织形态学变化，番红固绿染色判断骨缺损局部骨及软骨形成情况，Masson染色判断骨缺损处胶原形成情况；通过以上检测观察不同的SF支架复合材料对OVF骨缺损的修复作用；
(3)支架材料对OVF大鼠骨缺损伤椎成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用：①免疫荧光检测OVF大鼠L6伤椎BMP-2、Runx2、Osteocalcin、VEGFA、CTSK、CollagenII、IL-6、NF-кB、TNF-α蛋白表达情况；②WersternBlot检测OVF大鼠L6伤椎BMP-2、Runx2、Osteocalcin、VEGFA、CTSK、CollagenII、IL-6、NF-KB、TNF-α蛋白表达情况；
(4)支架材料对OVF大鼠血清雌激素水平、AKP活性及CTSK水平的影响：①取上述(2)中实验大鼠进行腹主动脉采血,离心获取血清,碱性磷酸酶测试盒检测M1、M2、M3、M4时间点血清AKP活性;②ELISA检测上述①中各时间点血清雌激素(Estrogen)、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)水平。
结果：
1.材料制备及表征结果：
(1)材料基本特征：我们通过冷冻干燥法成功制备了NG/GMs/nHA/SF复合支架，作为对照，我们还制备了SF、nHA/SF、NG/nHA/SF支架。随着不同材料的加入，支架的孔隙率有所下降。NG/GMs/nHA/SF支架孔隙率接近70%，为67.56±1.39%。在扫描电镜下，材料呈多孔结构。
(2)材料药物缓释性能：NG/nHA/SF支架材料可见突释效应，6h时释放了约50%，24h时释放了约80%，48h时释放了约90%。NG/GMs/nHA/SF复合支架可大大降低NG的突释效应，6h时释放小于35%，12h时释放小于50%，12h后可持续稳定缓释，至144h时，释放约90%。
(3)材料体外降解性能：含酶情况下，各材料降解较快，10d时nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF降解约80%，而无酶情况下，降解约60%。SF支架降解较慢，在含酶状态下10d时降解约60%，无酶状态下降解40%左右。
(4)材料生物力学性能：nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF复合支架压缩应力和压缩强度显著高于SF支架组(P＜0.05，P＜0.01)，且NG/GMs/nHA/SF支架具有最佳的力学性能。
2.细胞实验结果：
(1)BMSCs培养及流式鉴定结果：从2周龄雄性SD大鼠提取的BMSCs经过培养后显示出原代BMSCs形态(P0)，镜下P0代细胞可见到克隆球，且BMSCs呈梭形。通过流式鉴定，可见CD44、CD29、CD90(BMSCs阳性标志物)表达率分别为90.6%、91.5%、92.8%，CD34、CD45、CD11b/c(BMSCs阴性标志物)表达率分别为5.5%、3.3%、3.6%；
(2)支架材料对BMSCs增殖、成骨分化作用：①增殖作用：CCK8检测发现，与Control组相比，SF、nHA/SF、NG/nHA/SF和NG/GMs/nHA/SF复合支架材料体外均可促BMSCs增殖(P?0.05)，NG/GMs/nHA/SF复合支架材料效果最佳；②成骨分化作用：各材料与BMSCs共育3、7、10、14d后发现各材料组ALP、茜素红阳性染色及AKP活性逐渐增加，且NG/GMs/nHA/SF组效果最佳；
(3)支架材料对BMP-2、Runx2、OCN表达水平的影响：不同时间段，BMP-2、Runx2、OCNmRNA和蛋白表达在SF、nHA/SF、NG/nHA/SF、NG/GMs/nHA/SF支架组呈现增加趋势，且NG/GMs/nHA/SF支架组表达水平最高。
3.动物实验结果：
(1)大鼠OVF骨缺损模型的构建及评估结果：造模16周后，SD大鼠OVF模型L6椎体骨缺损未见明显自然愈合；
(2)支架材料对SD大鼠OVF骨缺损修复的作用：①肉眼观：材料植入4、8、12、16周后伤椎外观显示，NG/GMs/nHA/SF支架植入组新生骨组织较其他组多；②X线结果：NG/GMs/nHA/SF在不同时间点相比其他组愈合更佳；③micro-CT结果：micro-CT三维重建分析提示NG/GMs/nHA/SF在不同时间点相比其他组有更多的新骨生成，BV/TV、BMD也显著高于其余四组(P＜0.05)；④HE、番红固绿、Masson染色结果：HE染色提示NG/GMs/nHA/SF在不同时间点与其他组相比，具有更多的骨细胞、成骨细胞；番红固绿染色提示NG/GMs/nHA/SF组骨形成多余其余组；Masson染色提示NG/GMs/nHA/SF组相对于其他组有更多的胶原形成。以上结果共同证实了NG/GMs/nHA/SF复合支架可显著促进OVF愈合，且疗效较SF、nHA/SF、NG/nHA/SF组更满意；
(3)支架材料对OVF大鼠椎体成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用：①免疫荧光结果：在大多数时间点，NG/GMs/nHA/SF组BMP-2、Runx2、Osteocalcin、Collagen2、VEGFA、CTSK荧光表达强于其它组，IL-6、NF-кB、TNFR2表达低于其他组；②WB结果：在M4时间点，NG/GMs/nHA/SF组BMP-2、Runx2、OCN、Collagen2、VEGFA、CTSK蛋白表达高于其它组(P＜0.05)，IL-6、NF-кB、TNFR2蛋白表达低于其他组(P＜0.05)；
(4)支架材料对OVF大鼠血清雌激素水平、AKP活性及CTSK水平的影响结果：在大部分时间点，NG/GMs/nHA/SF复合支架组血清AKP活性、血清雌激素(Estrogen)显著高于其他四组(P＜0.05)，而CTSK水平低于其他组(P＜0.05)。
结论：
1.所制备的NG/GMs/nHA/SF复合支架是一种多孔材料，该材料可持续缓慢释放柚皮苷，且其具有良好的生物相容性、力学性能、生物可降解及骨诱导性能。
2.NG/GMs/nHA/SF复合支架材料可促进BMSCs增殖及成骨分化，其机制可能与上调BMP-2、Runx2、OCN的表达相关。
3.NG/GMs/nHA/SF复合支架材料可促进OVF大鼠伤椎骨缺损修复，其作用可能与该支架材料对成骨、成血管、胶原形成、破骨、炎症免疫相关因子的调控作用密切相关。