研究背景随着对超声生物学效应研究的深入,超声技术的临床应用已经从简单的疾病诊断进入到了疾病治疗阶段,对临床的多个学科具有重要指导意义。上世纪80年代,高强度聚焦超声(HIFU)开始应用于机械性治疗肾结石,而“碎石”迅速取代手术成为最常见的治疗选择。超声治疗的应用范围不断扩大,目前已批准的应用包括子宫肌瘤消融、白内障摘除(超声乳化术)、手术组织切割和止血、经皮给药、骨折愈合等。子宫肌瘤消融利用的是高强度聚焦超声(HIFU)的热效应,在肌瘤消融的同时,会对周围组织及血管造成损伤,引起炎性反应。与HIFU相比,低强度脉冲超声(LIPUS)的优势是具有作用范围局限可控,热效应可以忽略不计,有抑制炎症反应、促进骨折愈合、促进软组织再生的作用。由于在超声治疗过程中可能发生不良生物效应,因此在应用时必须仔细考虑标准化、超声剂量测定、效益保证和副作用风险最小化,以确保治疗性超声的安全性和患者的最佳效益风险比。超声造影剂的发展经历了几个阶段,SonoVue是我国获批上市并在临床上应用最为广泛的超声造影剂。它具有稳定性好、不易破裂且能产生较强谐波的信号等特点。超声造影剂可以增强超声的显像效果,最初只用于超声的诊断方面,但因为超声造影剂微泡本身作为空化核,可以增加超声的空化效应,因而与超声合用逐渐被应用于临床疾病的治疗方面。然而,两者联合应用在某些治疗方面的应用还有诸多问题亟待解决,如在机体各部位器官内存在的造影剂残留、对治疗部位周围正常组织的损伤等,这些问题有待进一步研究。肾脏肿瘤严重影响生存质量,会造成肾单位的减少和肾功能的恶化,很多患者已不能耐受手术治疗,非手术的替代治疗非常必要。本研究的目的旨在探索LIPUS、LIPUS合并SonoVue用于肾脏肿瘤的安全性及临床价值。存在的问题是一种新的治疗方法用于动物及人体实验之前,需要观察其对肾脏正常细胞的影响,如果对正常细胞无损伤,方可进行后续的后续的动物实验研究;如果对正常细胞存在损伤,则不能进行后续。因此,我们以HRGEC为研究对象,LIPUS联合SonoVue技术对HRGEC是否有作用,为临床治疗提供必要的基础实验数据。研究目的本部分旨在对比LIPUS或SonoVue造影剂二者单独及联合使用对体外培养的HRGEC的增殖与凋亡的影响,探索其潜在机制,初步探讨该技术方法的安全性。实验方法(见图1)将体外培养的HRGEC分为四组,分别给予四种不同的处理方案:(1)正常对照组(2)LIPUS超声处理组(3)SonoVue处理组(4)LIPUS和SonoVue联合处理组。超声照射设置为低强度脉冲超声,频率1 MHz,占空比为20%,作用时间为5 min。SonoVue造影剂浓度为20%。1.不同处理方法对HRGEC细胞的细胞毒作用分析首先,细胞经不同方法处理后,通过MTT实验测定HRGEC细胞增殖能力的变化,并对细胞进行台盼蓝拒染实验评估细胞活力变化,从而判断上述不同处理方法对细胞的毒性作用。2.不同处理方法对HRGEC细胞凋亡的影响用不同方法处理HRGEC,将细胞继续培养24小时,收集细胞并进行FITC-Annexin V/PI双标记流式细胞术分析HRGEC的凋亡情况。3.不同处理方法对ERK通路的影响用western blot方法检测HRGEC中ERK蛋白的总表达量及其磷酸化水平,以此来评估LIPUS和SonoVue联用对ERK信号通路的影响。并且用LIPUS和SonoVue联合处理HRGEC在不同时间点(12小时、24小时)检测了磷酸化ERK1/2的表达量。4.功能回复实验验证ERK信号通路的作用将HRGEC用10 μ mol/1 PD98059(ERK信号通路抑制剂)预处理1小时,再用LIPUS、SonoVue或LIPUS联合SonoVue处理细胞,western blot实验检测各组细胞中磷酸化ERK1/2蛋白的水平变化。此外,比较PD98059预处理后,经不同方法刺激的细胞在增殖率、活力、凋亡上的变化情况。实验结果1.LIPUS与SonoVue联用对HRGEC细胞的毒性作用分析HRGEC经LIPUS或SonoVue处理后,细胞活力及增殖程度较未处理前有统计学差异(P>0.05);而LIPUS与SonoVue联合处理可以使细胞存活率及增殖速度较其他组相比显著降低(均P<0.01)。2.LIPUS与SonoVue联用对HRGEC凋亡的影响尽管用LIPUS或SonoVue处理HRGEC不会对细胞造成严重的损伤,但LIPUS联合SonoVue处理后HRGEC出现大幅度凋亡,与对照组、LIPUS组及SonoVue组均有显著差异(均P<0.05)。3.LIPUS与SonoVue联用通过抑制ERK通路活性对细胞发挥作用不同处理组的细胞中非磷酸化形式的ERK1/2蛋白表达水平皆相似,而磷酸化的ERK1/2虽然在对照组、单独用LIPUS或SonoVue处理的HRGEC中均没有变化,但在LIPUS和SonoVue联合组中显著降低。经LIPUS和SonoVue联合处理的HRGEC,其磷酸化ERK1/2的表达量在12h即出现下调,且在24小时后下降程度更为显著,即抑制程度随处理时间增加而更加明显。此外,经过PD98059预处理后,四种不同处理组的HRGEC在增殖率、活力、凋亡水平上的差异无统计学意义(均P>0.05)。实验结论与LIPUS或SonoVue单独使用相比,二者联合作用可以抑制ERK信号通路,从而抑制HRGEC的增殖及活性,诱导凋亡。研究背景血管内皮形成循环血液和供给姐织之间的界面,对血管生物学稳定至关重要。细胞间的连接包括紧密连接、粘附连接、缝隙连接和桥粒半桥粒四种,其中内皮细胞间连接主要包含紧密连接(TJs)和粘附连接(AJs),AJs有助于细胞-细胞粘附的作用和稳定以及肌动蛋白细胞骨架和细胞内信号的调节。AJs主要由钙粘附素VE组成,属于钙依赖性粘附分子家族。与经典的钙粘蛋白类似,VE-cadherin与pl20连环蛋白和P-catenin结合,后者通过a-catenin将钙粘蛋白-连环蛋白复合物连接到肌动蛋白细胞骨架。VE-cadherin在血管内皮细胞中广泛分布并特异性表达。重要的是,VE-cadherin对于形成稳定、成熟的血管至关重要。此外,VE-cadherin阻断抗体会引起微血管通透性的增加。此外,VE-cadherin调节也会影响整个TJ结构和组织的信号通路。因此,VE-cadherin是许多涉及血管渗漏的分子通路的耙点。血管通透性在正常的血管中被精细地调节,能够适应血管周围微环境中的许多环境变化,包括血管生成、剪切应力、流动和炎症。细胞间连接,特别是VE-cadherin,积极参与血管屏障的这些改变。事实上,VE-cadherin的完整性可以通过多种途径改变,包括磷酸化、连环蛋白相互作用的失稳、血管化、脱落和肌球蛋白的收缩,所有这些最终都增加了内皮细胞的通透性。肾小球内皮细胞属于特殊的血管内皮细胞,有研究表明VE-cadherin在此细胞上有广泛分布并且参与了绝大多数肾脏疾病的发展过程。研究表明,超声造影剂可以降低超声的空化阈值,增加超声的空化效应,可以在细胞膜上“穿孔”(声孔效应),使细胞膜通透性增大。目前,研究超声和/或超声造影剂对细胞膜通透性影响的研究很多,但对细胞-细胞间通透性的影响及分子机制研究极少。前期实验显示LIPUS联合SonoVue通过抑制ERK1/2信号传导途径的活化,能够抑制HRGEC增殖,促进细胞凋亡,可能影响肾脏肾小球滤过。HRGEC的凋亡与细胞-细胞间的通透性有无关联以及LIPUS和/或SonoVue单独及联合作用是否会影响到肾小球血管内皮细胞的细胞间通透性、VE-cadherin是否参与以及其上游调控机制都尚不明确。实验目的本部分旨在LIPUS超声和SonoVue造影剂联合使用对HRGEC单层细胞通透性的影响,寻找相关影响因素,探索肾小球滤过屏障受损机制。实验方法1.不同处理方法对内皮细胞间通透性的影响采用Transwell细胞通透性实验,检测下腔小室中FITC-Dextran荧光强度,比较不同处理条件下HRGEC单层细胞通透性。2.不同处理方法对VE-cadherin表达的影响分别用实时荧光PCR和Western Blot方法检测不同处理后细胞VE-cadherin在mRNA和蛋白水平上的表达。同时,免疫荧光实验观察VE-cadherin蛋白在HRGEC细胞中的表达定位及表达量。3.不同处理方法对ETS相关基因(ERG)的表达及其对细胞间通透性的作用在经过不同方法处理后,western blot检测HRGEC内ERG蛋白的表达水平。用针对ERG特异的si-RNA转染HRGEC来干扰ERG,western blot检测其下游耙点VE-cadherin蛋白的表达水平。并通过FITC-dextranTranswel丨实验检测ERG表达受到干扰后细胞间通透性变化。另一方面,在HRGEC中过表达ERG基因,将细胞进行LIPUS、SonoVue及LIPUS联合SonoVue处理后,通过Transwell实验评估ERG基因过表达后各组细胞之间通透性的差异,判断不同处理方法所诱导的上述表型变化是否由ERG基因下调引起。实验结果:1.LIPUS联合SonoVue处理后,单层细胞通透性增强单独使用LIPUS和SonoVue对HRGEC进行处理都会导致细胞通透性与对照组相比有所提高,但二者联用可以造成细胞的通透性大幅度增加(P<0.01),且与单独处理组比较,差异有统计学意义(P<〇.05)。2.LIPUS与SonoVue联用降低HRGEC中VE-cadherin的表达经过LIPUS或SonoVue处理后,VE-cadherin的表达量较对照组相比没有发生显著性变化;当细胞经过LIPUS与SonoVue联合作用后,VE-cadherin mRNA和蛋白的表达量与其他组相比出现显著下降。同时,免疫荧光实验进一步直观地显示出LIPUS联合SonoVue作用后,细胞连接处的VE-cadherin蛋白表达量较其他组均明显降低。以上结果说明,LIPUS联合SonoVue处理可以通过降低细胞中VE-cadherin蛋白的表达量,使细胞间连接减少,从而影响细胞的通透性。3.LIPUS和SonoVue联用通过抑制ERG的表达影响细胞间通透性另外,在经过LIPUS和SonoVue联用处理后,ERG蛋白在HRGEC内的表达水平也显著降低。当ERG的表达被干扰后,VE-cadherin的表达水平亦显著下降,进一步表明ERG是VE-cadherin的上游调节因子。ERG基因千扰后细胞通透性明显増加,与LIPUS与SonoVue联用造成的结果类似。ERG基因过表达后,再将HRGEC进行LIPUS、SonoVue及LIPUS联合SonoVue处理,各组细胞之间通透性无明显差异(P>〇.〇5)。实验结论:LIPUS与SonoVue联用通过下调HRGEC细胞中ERG基因,抑制下游靶基因VE-cadherin的表达,増加了细胞间通透性,可能是肾小球滤过屏障受损的潜在机制。