研究背景和目的：自人类进入工业化以来,肿瘤的发病率就呈现上升趋势,泌尿系肿瘤一直是威协人类生命和健康的重大疾病。根据国外相关文献报道,2003—2007年间欧洲泌尿系肿瘤发病率一直呈上升势头,其中男性肾癌年发病率最高达31.4/100000,并且平均每年仍以3.7-7.0/100 000的速度增长；膀胱癌则是西方与亚洲国家最常见的尿路上皮癌,虽然近年来诊断与治疗技术均有较大提高,但是膀胱癌患病率及死亡率仍是逐年上升；睾丸癌一直是15—40岁男性的多发肿瘤,根据美国的统计结果显示,美国15—39岁西班牙裔白种男性中,1992年到2010年睾丸生殖细胞肿瘤的发病率增长了58%。国内泌尿系肿瘤的发病率相对较低,根据对中国30个主要市县的统计资料显示1998—2002年肾癌及泌尿系其他肿瘤的年发病率为6.63/100 000,但发病率呈上升趋势,其中以肾癌的发病率升高最快,肾癌虽然还不是影响我国居民生命及健康的前几位主要恶性肿瘤,但其逐年上升的趋势需引起重视[4]。多年来虽然肿瘤的诊断和治疗技术都有了极大提高,但肿瘤的发病率病死率仍在上升,研究更新更有效的诊疗方法对降低肿瘤危害,增进人类健康有积极意义。近年来,基于特定基因及蛋白分子的肿瘤标记物探索一直是研究热点。肿瘤标记物是指人体内血液、体液或组织中能提示肿瘤存在的生化指标,其存在与否?含量多少以及涉及活性大小对诊断肿瘤有重要价值。由于肿瘤的异质性,病理形态学上的分期分级不能全面评价肿瘤的生物学行为,寻找灵敏度高、特异性强的肿瘤标记物对肿瘤的诊断、预后判断与靶向治疗均有重大意义。我们在前期实验中通过联合应用转录组学和蛋白组学技术对前列腺癌组织中表达差异的基因进行了检测和筛选。通过对4组前列腺癌及其癌旁组织的RNA进行基因芯片杂交,所得荧光数据数值进行配对t检验(P<0.05),共发现1207个差异表达基因,其中差异表达基因上调的652个,差异表达基因下调的555个；再通过蛋白组学比对发现在配对的2566个蛋白点中,肿瘤组中有89个点上调明显(肿瘤/非肿瘤比率>2,P<0.01),66个点下调明显(肿瘤/非肿瘤比率<-2,P<0.01)。结合基因芯片及蛋白组学结果,找出共同表达差异明显的分子(蛋白质)14个,通过GEO数据库检索,在14个差异蛋白中筛选出6个候选蛋白作血液样本浓度检测。进一步通过对前列腺癌组织芯片的实验证实次黄嘌呤核苷酸脱氢酶2(inosine 5’-monophosphate dehydrogenase, IMPDH2)在前列腺癌组织中高表达并且与肿瘤的临床分期、病理分级、是否转移正相关,证实了此基因在前列腺癌诊断和判断预后方面的良好价值。IMPDH2在生物体中广泛表达,不仅在人和其他哺乳动物的各个器官中广泛存在,也可在微生物体内找到表达。人类细胞中含有两种IMPDH:即两个相近的同工酶IMPDH1和IMPDH2,在很多组织中两个亚型都有表达。每种同工酶亚型都是由514个氨基酸残基组成的蛋白,两种酶具有84%的氨基酸序列同源性。既往研究已知IMPDH是嘌呤生物合成的关键酶,它催化次黄嘌呤核苷酸(IMP)氧化为黄嘌呤核苷酸(XMP),随后XMP在GMP合成酶的催化下生成GMP,后者再转化为GTP和dGTP。GTP和dGTP是DNA和RNA合成的必须核苷酸,在核酸合成中,ATP相对合成较容易,GTP是限速的主要因素。该合成途径被称作是鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径,IMPDH催化的反应步骤是在该合成途径的限速步骤,起到限速酶作用。鸟嘌呤核苷酸对于DNA和RNA的合成是重要的酶底物,在活体细胞的生长分化、凋亡及在细胞信号传导过程中具有重要作用。IMPDH1是构成性表达,其表达通常发生在相对IMPDH2较低的水平中,而且不受细胞增殖、分化等影响。另一个同工酶IMPDH2则显示诱导性表达,是增殖细胞中的高度正调节标志,在增殖细胞和肿瘤细胞中的表达水平不断增强,一定程度上与细胞增殖速度正相关。因此,IMPDH2对于肿瘤研究意义重大。通过文献阅读,发现IMPDH2在结直肠癌、宫颈癌、黑色素瘤、白血病诸多肿瘤中均高表达,并且与肿瘤的病理分级与临床分期有一定关系,预示此基因对判断患者预后的良好价值。上世纪自Kononen等首次提出组织芯片的概念以来,组织芯片技术在癌基因的寻找、肿瘤发生发展及预后相关的生物分子标记物的确定,临床医学实验室诊断的内部质量控制、感染性疾病的确定等方面都有广泛的应用,并解决了许多疑难问题。组织芯片技术是人工将数十个到数百个小的组织样本整齐排列在载玻片上而形成的微缩阵列组织片。在试验过程中通过各种染色,包括常规的HE染色、组织化学染色、免疫组化染色、原位杂交显色等,通过显色在组织切片上获取基于形态学的基因组学和蛋白组学的多种表达信息。实现一张芯片获得多个组织检测数的目的。不仅如此,组织芯片技术可将形态学观察的结果提升到高标准化的层面,最大限度地降低主观人为因素以及客观检测条件对结果的影响。在肿瘤研究的实践中,越来越成为预测肿瘤患者的预后及分子靶向治疗标记物的重要依据。由于既往前人研究基础以及我们长期基因组学蛋白组学研究结果提示,基于上述实验方法在肿瘤标记物基础研究领域的重要价值。为了进一步探索IMPDH2的价值,本研究拟通过进一步收集前列腺癌组织标本从基因及蛋白水平检测IMPDH2在前列腺癌和良性组织中的表达差异情况,再通过大样本的组织芯片免疫组化验证IMPDH2蛋白在前列腺癌组织中的表达情况。应用组织芯片和免疫组化技术探索分析IMPDH2表达水平和前列腺癌患者临床病理特征的相关性,进而再利用肾癌、膀胱癌、睾丸癌组织芯片和免疫组化技术探索,分析IMPDH2在四种泌尿系最常见肿瘤中的表达情况,探索此基因参与泌尿系肿瘤的转移、复发等不良预后过程和证明其是否能够成为一个预测更多肿瘤生化复发、转移进展和预期寿命的独立指标及该蛋白作为肿瘤标志物的新价值。材料和方法1. IMPDH2在前列腺癌中的表达及临床预后研究1.1材料本研究经广州市第一人民医院伦理委员会批准,患者参与研究前均签署知情同意书及样本取材同意书。收集广州市第一人民医院泌尿外科2012年10月-2013年8月收治的住院患者标本用于荧光定量PCR和Western blot实验,包括20例前列腺癌病人临床标本(肿瘤患者均为首次被确诊前列腺癌,术前未经任何放疗、化疗及内分泌治疗,手术后切除组织立即送广州市第一人民医院病理科行冰冻及石蜡切片,病理均证实为前列腺癌,患者临床分期不限)及11例良性前列腺组织。(获取标本后马上放入液氮瓶中速冻,以-80℃低温保存至使用。另外再向上海芯超生物技术公司购买人类前列腺组织芯片(货号HPro-Ade180PG-01)用于IMPDH2免疫组化实验,此组织芯片包括96例前列腺癌及81例癌旁前列腺组织(这些病人在术前均没有接受抗雄激素治疗及放射治疗),公司提供详细临床资料。IMPDH2一抗试剂购自abcam公司(货号：EPR8364(B))1.2方法：1.2.1 RT-PCR利用荧光定量PCR检测IMPDH2在前列腺癌和前列腺增生组织之中的表达情况.从RNA样本从以逆转录法获得cDNA样本,以p-肌动蛋白作为IMPDH2基因引物的内参,基因的表达情况用荧光定量PCR法验证,利用样本与内参样本的PCR循环值对比得出样本基因表达情况。1.2.2 Western blot用传统Western blot法检测组织中蛋白表达情况,抽提前列腺癌和良性前列腺增生患者组织中的蛋白质制成蛋白悬液,48小时后进行Western blot分析,先以SDS-PAGE电泳跑胶,再经5%的SDS-PAGE浓缩胶和10%SDS-PAGE分离胶,分别予100 V恒压电泳30min,60 V恒压电泳1h。肉眼观察至溴酚兰跑出则终止电泳,然后可以进行转膜。转膜后加入先后用TBST稀释的兔抗人IMPDH2蛋白单克隆抗体(美国abcam,浓度1：1000)、(HRP)标记的抗IgG抗体(1：5000)孵育后经过发光,显影,定影,最后结果经凝胶胶片扫描,以凝胶图象分析工具系统地分析目标带的分子量和净光密度值,读取数据,统计分析。1.2.3免疫组化二甲苯脱蜡免疫组化按SP法试剂盒(abcam公司(货号：EPR8364(B))要求操作,多克隆抗体IMPDH2工作浓度为1：150,DAB试剂盒显色,苏木素复染胞核,以PBS替代一抗作为阴性对照。免疫组化结果及评分先由两个经验丰富的病理医师单独评估,两位病理医师事先不知道患者的临床资料,当出现意见不符的结果时通过共同评估决定最终评分。每个样本观察10个具有代表性的显微镜视野并确定阳性染色部位、阳性染色细胞的数量。评分标准根据阳性染色细胞百分比得分与染色强度得分共同计算,其中阳性染色细胞百分比得分标准为：0分(小于5%),1分(5-15%),2分(15-50%)和3分(>50%).染色强度评分标准为：0分(完全不着色),1分(淡黄色+),2分(深黄色++),3分(棕褐色染色+++)。最终总的免疫组化得分(IRS)根据阳性染色细胞百分比得分与染色强度得分相加得出。IRS≥4分定义为高表达,<4分为低表达。并对评分结果进行统计学分析。2. IMPDH2在泌尿系统的临床筛查研究2.1材料含有详细临床资料的肾脏、膀胱、睾丸组织芯片则购自西安艾丽娜公司,肾组织芯片编号KD244,含有12组肾癌组织与配对癌旁对照组织,患者包括9位成年男性及3位女性,年龄介入33岁至76岁平均年龄55岁,芯片资料包括患者病理分级临床分期及TNM分期。膀胱组织芯片编号BL481,包括39例膀胱癌组织和8例正常对照,含有35位男性和12位女性患者年龄介于21至88岁,平均年龄54岁,芯片资料包括患者病理分级临床分期及TNM分期。睾丸组织芯片编号TE281,包括40例睾丸癌组织与8例正常对照,患者年龄介于15至81岁平均年龄43岁,芯片资料包括患者TNM分期,无病理分级、临床分期。2.2免疫组化对肾脏、膀胱、睾丸组织芯片进行免疫组化检测,检测方法与前列腺癌组织芯片相同。3.统计分析方法采用SPSS 18.0 (SPSS Inc, USA)软件包进行数据处理。IMPDH2 mRNA在PCa和良性组织之中表达的差异情况以及western blot检测前列腺癌和良性组织之中表达的差异情况进行两独立样本t检验,方差不齐则采用t’检验。Pearson卡方检验分析IMPDH2在PCa和良性组织中免疫组化染色差异情况以及IMPDH2蛋白染色和癌肿临床病理的相关联系。前列腺癌表达谱Taylor数据mRNA得分和前列腺癌临床病理参数之间的比较采用多组均数间one-way ANOVA方差分析；LSD法两两比较,P<0.05有统计学意义。对肾癌及癌旁组织差异表达的蛋白由软件进行配对t检验,膀胱癌及正常膀胱组织、睾丸癌及正常睾丸组织进行独立样本t检验,用Wilcoxon秩和检验比较前列腺癌和正常组织的免疫组化评分,以两独立样本t检验比较它们在肿瘤组织之中的免疫组化评分统计肿瘤组织内不同病理分级、临床分期与TNM分期之间IMPDH2的表达差异,以上各项检验方差时不齐则采用t’检验。正态分布的计量资料X±s表示；P<0.05表示有统计学意义。4.结果4.1我们前期实验利用基因芯片在前列腺癌组织中筛选出上调表达的MCCC2, TRAP1和IMPDH2基因,其中IMPDH2上调倍数最高,升高的倍数达到1.98倍(P=0.018)(图1)。4.2 IMPDH2在前列腺癌中的表达情况RT-PCR结果显示：IMPDH2 mRNA在前列腺癌中的表达水平相对于前列腺增生症组织中明显上调(9.22±2.49vs 5.06±1.45,P<0.01)。Western blot结果显示：IMPDH2在前列腺癌中的表达水平高于前列腺增生症组织(PCa=0.674±0.029 vs Benign=0.418 ± 0.140, P<0.001)。免疫组化结果显示：实验证明IMPDH2蛋白在前列腺癌组织中表达的阳性信号为棕黄染色,绝大部分表达在胞质和胞膜,少部分表达在胞核,在前列腺癌组织中表达的阳性率为100%。良性组织中阳性表达在胞质,阳性表达率为80%。IMPDH2蛋白在前列腺癌组织中总体呈现高表达,显著高于良性组织组织(P<0.001)。在前列腺癌中IMPDH2蛋白在低中度表达和高表达组间,与患者肿瘤分期,是否转移,肿瘤临床进展方面均有明显统计学意义。IMPDH2蛋白在前列腺癌中的表达与患者年龄无差异(P=0.362)。在高级别的前列腺癌中表达明显高于低级别,P=-0.002)。在转移性前列腺癌中的表达亦高于非转移前列腺癌(P=0.000),在进展期前列腺癌中的表达也显著高于局限性前列腺癌(P=-0.000),对应的Taylor数据也证明了我们的免疫组化结果。4.3 IMPDH2在泌尿系其它肿瘤中的表达情况IMPDH2蛋白在肾癌及癌旁组织中表达的阳性率为100%。IMPDH2蛋白在肾癌组织中总体呈现高表达,明显高于癌旁对照组织(IRS:KDCa=4.67±1.07 vs compare=3.42±0.99 P=0.020)。在肾癌旁中IMPDH2蛋白表达与患者年龄、肿瘤分期、病理分级方面无统计学意义的关联。在膀胱癌中表达的阳性率为92.31%(36/39),在正常膀胱组织中表达率为100%但是均表达在膀胱粘膜表层,尤其是盖细胞处。IMPDH2蛋白在膀胱癌组织中总体呈现高表达(4.33±1.88),明显高于正常对照组织(2.88±0.35,P=0.00)。在膀胱癌组织中IMPDH2蛋白表达与患者年龄、肿瘤分期、病理分级均无统计学意义的关联。IMPDH2蛋白在睾丸癌及正常睾丸组织中表达的阳性率均为100%。。IMPDH2蛋白在睾丸癌组织中总体呈现高表达(4.22±1.31),但是在正常睾丸组织中也显示高表达(4.25±0.46),两者并无统计学差异P=0.960)。在睾丸癌组织中IMPDH2蛋白表达与患者年龄、肿瘤分期、病理分级方面无有明显统计学意义。结论1、与良性前列腺组织相比,IMPDH2在睾前列腺癌中表达明显上升。与癌旁细胞相比,IMPDH2在肾癌中的表达明显增强；与正常细胞相比,IMPDH2在膀胱癌中的表达明显增强；与正常细胞相比,IMPDH2在睾丸癌中的表达差异不大。2、IMPDH2的表达在肾癌、膀胱癌、睾丸癌病人不同病理分级与临床分期间并无明显差异。在前列腺癌中,此蛋白表达与患者临床分期、是否转移、Gleason评分均正相关。3、IMPDH2在泌尿系肿瘤的诊断与治疗中具有一定作为肿瘤标志物的价值,有可能作为肾癌、膀胱癌、前列腺癌的诊断标志与生物靶向目标,其中作为前列腺癌的肿瘤标志物价值最高。