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中心体是动物细胞的细胞器,由一对垂直的中心粒及中心粒外周物质组成,是细胞内的主要微管组织中心。中心体可以调控很多生命活动,例如建立细胞极性、纤毛形成、维持细胞形态、细胞分裂和细胞迁移等。目前中心体异常在多种肿瘤和神经性退行性疾病种均有报道,其异常可作为肿瘤在临床上检测标志。但是中心体的复制过程复杂,对其复制机制研究仍然不足。从理论上讲,研究清楚中心体的复制过程,将对在临床上对中心体异常类疾病提供潜在的治疗方案PCL2由 593个氨基酸成,大小为67kD,包含Tudor、PHD1/2、EH等结构域。PCL2最初在果蝇中发现,随着人们对表观遗传学的研究深入,PCL2作为表观遗传复合物PRC2的一个亚驻而逐渐被认知,PRC2复合体可以被PCL2募集到低甲基化的CpG岛上对组蛋白H3的27位赖氨酸进行一/二/三甲基化。然后H3的27赖氨酸的三甲基化被PRC1复合体进行识别,对组蛋白H2A的119位赖氨酸进行泛素化,从而对基因转录的抑制。除此之外,PCL2也能调控P53的稳定性。当下对其的研究主要集中在细胞核内基因组的表观调控领域,而在其他方面的研究报道甚少。本文研究了 PCL2在中心体复制过程中的作用及调控机制,加深了对其功能上的认知。本研究表明,PCL2可被CCNA2招募并与中心体上的Sas-6结合,PCL2通过与PLK4直接相互作用,调控Plk蛋白水平来调控中心体的复制。本研究加深了对中心体复制这个复杂生命过程的认知,为临床上中心体异常类疾病的治疗提供了新的思路及靶点。研究目的:研究PCL2在中心体复制过程中的作用及调控机制。研究方法:1.对细胞进行同步化处理,通过Western blotting和免疫荧光实验检测PCL2蛋白在各个细胞周期的蛋白水平及定位变化。2.通过GeneMANIA预测可能与PCL2相互作用的中心体复制相关蛋白。3.免疫荧光检测PCL2与中心体蛋白γ-tublin、Sas-6、Cep97是否存在共定位,Co-IP实验检测PCL2是否与中心体的蛋白存在直接相互作用。4.免疫荧光检验PCL2与CCNA2是否存在共定位。敲低CCNA2后,免疫荧光检验PCL2向中心体聚集情况,Co-IP研究检验PCL2与CCNA2之间的相互作用。5.过表达PCL2后,免疫荧光检测中心粒数目的变化。6.分别过表达及敲低PCL2,通过Western blotting、q-PCR检测PLK4蛋白及mRNA水平变化,利用免疫荧光及Co-IP检验PLK4与PCL2是否存在共定位及相互作用。研究结果:1.同步化细胞后Western blotting结果显示,随着细胞周期改变PCL2蛋白水平改变,其在S期的蛋白表达水平最高,免疫荧光结果显示随着细胞周期变化PCL2在细胞内发生聚集,表明PCL2参与了细胞分裂相关的生命活动。2.通过GeneMANIA分析发现,PCL2与PLK4,CCNA2,CEP135存在共定位,表明PCL2可能参与调控中心体复制的过程。3.同步化细胞后免疫荧光结果显示,PCL2与γ-tubulin在S期至G2/M期存在共定位并与Sas-6、Cep97存在共定位。Co-IP结果显示PCL2与Sas-6存在直接的相互作用。4.免疫荧光及Co-IP结果显示,PCL2与CCNA2存在共定位和直接相互作用,敲低CCNA2后,免疫荧光结果显示PCL2不再向中心体聚集,表明CCNA2能影响PCL2向中心体的定位。5.细胞过表达PCL2后,免疫荧光结果显示中心体不能正常分离且数目出现异常。6.细胞过表达和敲低PCL2后,Western blotting和q-PCR结果显示,PLK4蛋白水平发生显著变化,而mRNA水平没有显著变化。免疫荧光和Co-IP结果显示,PCL2与PLK4存在共定位且直接相互作用。结论:1.PCL2参与调控细胞分裂相关生命活动。2.GeneMANIA分析PCL2参与调控中心体的复制。3.PCL2与中心体存在共定位,并与中心体蛋白Sas-6存在直接相互作用。4.敲低CCNA2可阻碍PCL2向中心体的定位。5.PCL2蛋白水平变化导致中心体数目异常。6.PCL2通过调控Plk4蛋白水平来调控中心体复制。