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浮游植物是海洋最重要的初级生产者,其生长和死亡显著影响海洋生态系统结构和生物地球化学作用。然而,目前对自然海区浮游植物死亡的调查研究还较少,对浮游植物死亡的机理和生理生态响应也并不清楚。本文主要利用现场调查研究和实验生态相结合的手段,研究亚热带海湾浮游植物死亡及其影响因子,利用分子生物学技术手段研究东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)对营养盐限制条件下的死亡机理-细胞程序性死亡。取得的主要结果如下: 1.厦门湾浮游植物的死亡比率 利用细胞消解法并结合Cytosub流式细胞仪对厦门湾东部海域不同类群浮游植物死亡比率进行周年(每2周一次)研究。根据浮游植物细胞光谱特征、所采集的浮游植物图像信息以及实验室内单种培养的浮游植物的聚类结果,将现场水样中的浮游植物聚类分成6个类群(G1-G6),其中G1是除聚球藻外的其它蓝藻类;G2是聚球藻类群,为优势类群;G3属于隐藻类群;G4和G5同属于nano-真核类,前者也是优势类群;G6是硅藻为主的micro-真核类。 在调查期间各个类群的细胞死亡比率差异较大。G1的死亡比率基本都低于15%; G2死亡比率总体呈现春夏低,秋冬较高的趋势;G3对盐度很敏感,盐度低于28,其死亡比率小于20%,当盐度高于28,其死亡达到70-100%,明显高于其他类群的死亡比率。如此高的死亡比率,表明死亡是浮游植物细胞损失的主要途径,是调节隐藻细胞丰度和群落结构季节性变化的重要因素;G5的死亡比率基本都比较低,特别是在夏末和秋季,其细胞基本都是存活的;G6的死亡比率与硅浓度呈显著负相关,主要是因为G6是以硅藻为主的类群。每个类群的死亡比率都有高于50%,也进一步表明浮游植物死亡是不可忽略的,直接影响其丰度及群落组成。G4在春夏对总体死亡细胞的贡献最大,约54%,而在秋冬季,G2的死亡细胞贡献的最大,60-70%。浮游植物总的平均死亡比率呈现夏季最低(16±6%),春、秋季次之,冬季最高(达27±16%),其变化趋势和叶绿素a浓度的变化呈相反趋势。结果表明浮游植物死亡具有季节性,不同类群对环境因子的响应各不相同。本研究的采样站位处于亚热带海区,终年水温较高,光照充足,营养盐比较丰富,其浮游植物死亡最主要最主要的因素是温度和盐度。即使在这么适合浮游植物生长的环境条件下,年平均死亡比率仍达到20.5%,可见浮游植物死亡是研究其动态变化的重要部分。因此,浮游植物的细胞死亡过程是研究水生生态系统和生物地球化学过程中不可忽略的过程。 2.九龙江河口浮游植物的死亡的比率 2014年2月和6月研究了九龙江河口区不同盐度梯度(0-28.5)水域浮游植物的死亡。该区域营养盐浓度比较丰富,呈现随着盐度增加而逐渐减少的趋势。浮游植物每个类群在枯水期(2月)和丰水期(6月)的分布各不相同,除了粒径较大的类群G3和G6外,枯水期其他类群的丰度都明显低于丰水期,并且枯水期的叶绿素a浓度也是主要由G3和G6贡献,而丰水期主要由G2和G4贡献。 在调查期间各类群的死亡比率变化较大,G1的死亡比率最高为70.05-100%,明显高于其他类群;G2丰水期的死亡比率平均为26%,明显低于枯水期;G3在枯水期的死亡比率基本是在盐度低的站位较高,而在丰水期呈相反的趋势。在枯水期G2、G4和G6是对总死亡细胞贡献最大的3个类群,且G2的死亡贡献和G4呈相反的趋势,而G6总体上是随着盐度增加死亡贡献也增加;在丰水期G4和G5是死亡贡献最大的2个类群,且G4在盐度高于3.7(A9)的站位死亡贡献相对较大,在盐度小于3.7(A9)的站位,死亡贡献最大的是G5。枯水期总死亡比率基本都>50%,明显比丰水期高,远高于稳定的生态系统,表明细胞死亡是细胞损失的主要途径,已经严重影响到其类群丰度和演替过程。而影响浮游植物死亡的主要因素是盐度,一个类群的存活状况取决于其对盐度的适应。 在调查期间,营养盐浓度总体较高,甚至各个营养盐的最低浓度都没有限制浮游植物的繁殖和生长。然而在温度、光照、营养盐都适合浮游植物繁殖生长的丰水期,浮游植物却没有出现藻类大量繁殖甚至形成藻华的现象,主要是受N/P比(80-200)的影响,九龙江河口属于磷限制潜在性富营养级别,但由于营养盐绝对浓度较高,仍有水华暴发的潜在风险,因此需要加强对九龙江河口浮游植物丰度和死亡的监测,为藻华的预警预测和水域管理提供依据。 3.磷限制条件下东海原甲藻细胞程序性死亡的研究 利用蛋白和基因表达等分子生物学技术来研究东海原甲藻在磷限制条件下的细胞程序性死亡。结果发现东海原甲藻在无机磷浓度低于检出限的磷限制组的细胞数量明显低于磷充足组,并提前进入生长的平台期,并且以一定细胞丰度维持一段时间。由于受到磷限制的胁迫,其Fv/Fm明显低于磷充足组,并伴随着大量的活性氧(ROS)产生,在这过程中,有caspases-like活性的细胞也大量增加,其所占的百分比和有活性氧产生的细胞的百分比呈现明显的线性正相关。证明了环境因子是通过活性氧作为信号分子传递信号来激活caspases-like蛋白活性进而诱导细胞程序性死亡。 磷限制组的caspases-like活性、类caspase-3活性的表达、metacaspase的基因表达远远高于磷充足组,但其死亡比率却与这些参数不匹配,并没有大量细胞死亡出现,反而后期磷限制组的细胞存活率和细胞生长率都高于磷充足组,表明并不是所有的metacaspase基因表达的蛋白都执行细胞程序性死亡的功能,反而参与适应磷限制的过程,提供基因进化优势,优化细胞对不利环境条件的适应,致使东海原甲藻在磷限制条件下并没有立即消亡,而是保持一定丰度生存着。可见细胞程序性死亡是有利于磷限制条件东海原甲藻的存活,一方面,在磷有限的条件下,会主动让部分细胞死亡,重新释放出有机物为更多的细胞提供资源而获得生存机会,以维持种群的生长;另一方面,caspases-like和metacaspase扮演双重角色,不仅发挥诱导和执行致死的功能,更多的是在使细胞适应磷限制这方面发挥着重要的作用,这就为解释东海原甲藻水华在营养盐限制(特别是磷限制)的条件下,还能以高细胞丰度维持一段时间提供新的见解。