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水稻细菌性条斑病是由水稻黄单胞杆菌条斑致病变种Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola(Xoc)侵染引起的细菌性病害,简称细条病,是亚洲和非洲地区水稻生产的重要病害。抗病相关基因的发掘不仅有利于农作物产量的提高,而且是植物与微生物互作基础研究的一个重要课题。
本课题组前期通过水稻细菌性条斑病差异蛋白质组学分析,分离出一个拟抗病蛋白OsPDRH9N,并通过反向遗传学的方法获得了超量表达OsPDRH9N基因的转基因植株。生物信息学分析显示OsPDRH9N蛋白是一个包含NB.ARC保守结构域的NBS-LRR类蛋白质,该类蛋白质在动物体的细胞凋亡、植物体的超敏反应中发挥重要的作用;OsPDRH9N可能响应光调控、生物以及非生物胁迫。为了进一步研究OsPDRH9N的生物学功能,鉴定其参与的生理过程,本论文开展了以下几个方面的研究,主要结果如下:
通过Southern Blot、侧翼序列扩增技术分析转基因植株的拷贝数和插入位点,结果表明,T2代转基因植株中有l株纯合、单拷贝且超量表达OsPDRH9N基因的植株,外源基因插入位点为水稻第二号染色体LOC Os02g44380.2基因的第十个内含子。
荧光定量PCR数据表明,正常生长条件下,OsPDRH9N基因的超量表达上调水杨酸合成关键基因CHS,茉莉酸合成关键基因AOS,以及病程相关基因PR1α、PR1b2和PR1#12的表达,说明OsPDRH9N参与了SA、JA和抗病信号途径。水稻细菌性条斑病病原菌侵染的条件下,OsPDRH9N基因的超量表达没有引起病斑表型的明显变化,但在mRNA水平上,水杨酸合成关键基因CHS、ICS和NPR1,茉莉酸合成关键基因AOS以及病程相关基因PR1α的表达均被Xoc上调,说明转基因植株对Xoc的侵染更具敏感性。
OsPDRH9N基因的逆境表达谱分析表明,OsPDRH9N受各种防御信号化合物不同程度的诱导表达,脱落酸快速上调OsPDRH9N基因的表达,而水杨酸和双氧水快速地抑制OsPDRH9N基因的表达。对T1代超量表达OsPDRH9N基因的转基因植株外施脱落酸,发现相比于野生型,转基因植株的种子萌发和侧根生长不受脱落酸的抑制。
通过构建OsPDRH9N蛋白质第169至453位氨基酸的原核表达载体,体外表达并且纯化GST-OsPDRH9N169-453融合蛋白,以此蛋白作为生产检测水稻OsPDRH9N蛋白质的多克隆抗体和体外初步检测ATP酶活性的材料。结果表明,所得的多克隆抗体能够特异性的检测水稻内源OsPDRH9N蛋白,此外,GST-OsPDRH9N169-453融合蛋白还显示了微弱的ATP酶活性。
综上,OsPDRH9N基因超量表达转基因植株对Xoc的侵染更具敏感性,OsPDRH9N可能参与ABA信号、光信号调控系统,OsPDRH9N蛋白质可能具有ATP酶活性。