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慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是由于9号染色体与22号染色体易位形成Bcr-Abl融合基因而引起的恶性血液肿瘤,该融合基因编码产生具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白,该蛋白可通过激活下游多条信号通路,发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。因此,研究CML细胞凋亡被抑制的分子机制对CML发病机制及治疗具有重要意义。凋亡诱导因子(Apoptosis-Inducing Factor, AIF)是参与非依赖caspase凋亡途径的重要分子,它是一种黄素蛋白,正常情况下定位在线粒体内膜上,起着电子传递的作用,参与能量代谢。当细胞受到凋亡刺激后,AIF从线粒体异位到细胞浆,最后进入细胞核,将DNA切割成约50 kb的大片段,导致细胞凋亡。经研究发现,AIF从线粒体释放与线粒体膜的通透性、钙蛋白酶等有关,Luigi等在Apaf1-/-HeLa细胞中发现热休克蛋白-70(Heat Shock Protein-70, HSP70)能够阻止AIF入核,从而阻止细胞发生凋亡样细胞死亡。然而,AIF在CML细胞凋亡被抑制中的作用机制尚不清楚。为了进一步了解AIF在CML发病中的作用,我们的研究思路是：构建野生型凋亡诱导因子(Ad-Apoptosis-inducing factor,Ad-AIF)、缺线粒体定位信号结构域的凋亡诱导因子突变体(Ad-Apoptosis-inducing factor defected mitochondria localization sign, Ad-DMLS-AIF)和缺HSP70结合位点的凋亡诱导因子突变体(Ad-Apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF)的重组腺病毒载体,感染白血病K562细胞后,观察Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF对慢粒白血病K562细胞凋亡的作用,探讨AIF与CML细胞凋亡异常之间的关系。主要的实验内容及方法：1.构建Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF重组腺病毒载体。将K562细胞的cDNA作为模板,通过PCR得到的AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段分别克隆至穿梭载体pAd-Track-CMV-HA质粒中,经双酶切、PCR和测序鉴定后,分别与骨架质粒pAd-Easy1重组,得到的重组腺病毒质粒分别经Pac Ⅰ线性化后,转染AD293细胞,进行包装和扩增,即得到Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF重组腺病毒,同时将pAd-Easy 1质粒进行包装和扩增,得到空载腺病毒,作为实验对照。在空载腺病毒和三种重组腺病毒感染K562细胞48 h时,通过western blot验证其在K562细胞中的表达。2.观察Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。在空载腺病毒和三种重组腺病毒感染K562细胞0 h、24 h、48 h、72 h时,使用CCK-8检测各组腺病毒对K562细胞生长抑制的程度；在48 h时,通过Hoechst33258染色观察K562细胞核形态的改变,流式细胞术检测K562细胞凋亡情况；在24 h时,免疫荧光染色检测重组腺病毒表达蛋白在K562细胞中的定位,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合。通过以上方法,我们得到以下结果：1.通过双酶切、PCR和测序鉴定,构建的穿梭质粒正确Pac I酶切得到特异性的大小为4.5 kb的DNA片段,说明Ad-AIF Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF构建成功；Western blot检测到三种重组腺病毒在K562细胞中的表达。2.CCK-8实验结果显示与未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组相比,随着时间的增加,Ad-DHBD-AIF对K562细胞生长抑制程度也增加。Hoechst33258染色发现Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组的K562细胞染色质分布均匀；流式细胞术检测发现Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡的数目明显高于未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组。免疫荧光染色检测发现,DHBD-AIF能进入细胞核,AIF和Ad-DMLS-AIF均滞留于胞浆中；免疫共沉淀检测发现AIF和DMLS-AIF均能与HSP70相结合,而DHBD-AIF不结合HSP70。综上所述,三种重组腺病毒构建成功,感染K562细胞后,与未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组相比,Ad-DHBD-AIF能够引起K562细胞发生明显凋亡,其表达的蛋白不与HSP70结合,并且能够进入细胞核,说明在K562细胞中,AIF与HSP70结合可使AIF滞留于胞浆中,不能发挥促凋亡的作用,从而表现出抵抗凋亡的现象。