恶性肿瘤是威胁人类生命的第一大致死因素。据统计，2008年全球新发恶性肿瘤1270万例，死亡760万例。全球每年新增乳腺癌约130万例、死亡约45万例，乳腺癌已经成为女性最常见的恶性肿瘤和主要致死原因。研究证实，乳腺癌的发生一般经历乳腺上皮增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌一系列过程。在乳腺癌恶性转化及进展过程中细胞发生一系列复杂的分子生物学及生物学行为变化，如何调控恶性转化及进展过程中这一系列变化的机制尚不清楚。对乳腺上皮细胞向乳腺癌的恶性转化和进展机制的研究，不但有助于深入理解乳腺癌的发病机制，而且有望发现新的乳腺癌治疗靶点。近年来的研究表明，多种磷脂代谢产物参与了细胞信号转导的调控，其中鞘磷脂的活性代谢产物1-磷酸鞘氨醇（sphingosine1-phosphate,S1P）既可以作为细胞内第二信使发挥作用对细胞周期进行调控，又可与细胞表面的特定受体结合而调节细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移及粘附分子表达等。在S1P生物合成过程中，鞘氨醇激酶（sphingosine kinase, Sphk）起到关键限速作用。目前已发现，Sphk在人类和小鼠组织中存在Sphk1和Sphk2两种异构体。人类细胞中，Sphk1基因位于17号染色体，Sphk2位于19号染色体。尽管Sphk1和Sphk2基因的保守区高度同源，结构上也有相同的C1～C4区及羧基末端，但二者的组织分布和催化活性却并不相同。Sphk1缺少跨膜结构域，而Sphk2有多个跨膜结构域，且两者的表达有不同的时相性。这些都提示Sphk1和Sphk2有不同的生物学功能及调控机制。Sphk1分子主要分布在脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏和造血免疫系统，是细胞调节S1P生成的最主要分子，与多种肿瘤细胞的过度增殖有关。研究表明，Sphk1具有癌基因的特性，可促进细胞在软琼脂中的克隆形成，将Sphk1转染到NIH313成纤维细胞后，这些细胞在体外的生长过程中会失去接触生长抑制，将其移植到NOD/SCID小鼠体内后能够成瘤。Sphk1表达水平在多种肿瘤组织中都明显高于正常组织，如肺癌、胃癌、子宫内膜癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、甲状腺癌、颅内肿瘤、结肠癌、肾癌和非霍奇金淋巴瘤等。在肝脏中的研究显示，S1P可刺激肝脏星状细胞和成纤维细胞增殖导致肝纤维化并使其处于恶化前的病理状态，而抑制Sphk1能诱导人肝脏肿瘤细胞分化逐渐丢失恶性表型，提示Sphk1/S1P途径对于肝细胞肿瘤形成可能起到关键性的作用。Kohno M等通过建立Apc Min/+小鼠大肠息肉模型，发现肠息肉在转化为腺瘤的过程中Sphk1表达升高，并且对于腺瘤上皮细胞的增殖起着非常重要的促进作用；而在Apc Min/+SPHK（-/-）模型中，腺瘤上皮细胞的增殖受到了抑制。课题组前期对乳腺癌临床标本的研究也发现，Sphk1在正常乳腺组织中无表达，在非典型增生组织中有弱表达，而在乳腺癌中强表达，表明Sphk1在乳腺癌发生过程中可能发挥了重要的作用。以上这些研究提示， Sphk1无论是在间质细胞还是在上皮细胞发生恶性转化的过程中都可能发挥了关键作用。同时，Sphk在恶性肿瘤演进过程中也可能发挥了重要的作用。Sphk1可将肌动蛋白从黏合点根据迁移的需要再分配到细胞膜褶边板状伪足。上调Sphk1将导致内皮细胞迁徙重新响应和促进迁移。Sphk1也是系膜细胞核苷酸诱导迁移所必需。Sphk1是多种细胞表面受体的复合位点，其中LPA、S1P、EGF的受体都已被证明参与调节肿瘤细胞的迁移和侵袭。Shida D等报道LPA1（Lysophosphatidic acid）与EGFR受体在相互作用之后会促使Sphk1的表达水平增高，从而促进胃癌细胞的迁移和侵袭。抗转移分子KAI1可下调Sphk1活性从而抑制胰腺癌细胞转移，还可通过下调肝细胞生长因子介导的Sphk1活化从而阻止肝癌细胞发生转移。Ruckhaberle E等发现瘤体低表达Sphk1的乳腺癌患者的转移风险也较低。这些结果表明，Sphk1可能是细胞迁移的关键调控因子，可促进肿瘤细胞侵袭转移。然而，也有相反结果的研究报道，与正常人相比，前列腺癌患者循环红细胞中S1P水平和Sphk1活性较低；而且在激素无反应性前列腺癌中，循环S1P水平降低是肿瘤进展的标志，且与前列腺癌特异抗原（PSA）水平、淋巴结转移以及死亡率有关。该研究提示，Sphk1可能抑制了前列腺癌的进展和转移。由此可见，Sphk1可能促进了恶性肿瘤细胞发生侵袭和转移，但仍存在争议，在不同肿瘤或不同肿瘤患者中可能发挥了不同的作用，且其促转移或抑转移的机制仍不清楚，在乳腺癌中的作用尚未阐明。系统回顾Sphk1在乳腺癌领域的研究成果，我们发现，已有的研究大多集中于乳腺癌细胞系，对其在乳腺正常上皮发生恶性转化中的作用研究甚少。同时，Sphk1的表达情况与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系至今尚无明确结论，对Sphk1在乳腺癌进展中的具体作用和机制的研究和认识甚少，而其是否参与乳腺癌的侵袭转移过程、具体作用及分子机制如何，尚待进一步研究。针对上述问题，本研究通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）的方法检测乳腺癌组织Sphk1蛋白表达情况，并分析其与患者临床病理特征及上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）关键蛋白E-cadherin（E-cad）表达的关系。通过采取化学致癌剂二甲基苯蒽（DMBA）诱导人正常乳腺上皮细胞（MCF-10A），使其发生恶性转化，采取RT-PCR、Western-blot方法检测其Sphk1、E-cad的mRNA和蛋白表达情况，并分析Sphk1与细胞增殖和侵袭能力的关系。通过慢病毒感染方法使MCF-10A细胞过表达Sphk1，并用Sphk1激动剂肿瘤坏死因子（TNF-α）、Sphk1抑制剂二甲基鞘氨醇（DMS）处理过表达Sphk1的MCF-10A细胞，通过siRNA干扰人乳腺癌细胞系（MCF-7）的Sphk1表达，采取RT-PCR和Western-blot法检测Sphk1及E-cad的mRNA和蛋白表达情况，采取CCK-8法检测细胞的增殖能力，Transwell法检测细胞侵袭能力，分析Sphk1与细胞增殖和侵袭能力的关系，探讨TNF-α/Sphk1/E-cad通路在乳腺上皮恶性转化及乳腺癌进展中的作用。通过上述研究以期初步探讨Sphk1在乳腺癌发生与进展中的作用及分子机制，为进一步揭示Sphk1在乳腺癌中的生物学功能提供实验依据，为乳腺癌分子靶点的研发提供新的思路。试验方法和主要结果：1. Sphk1与乳腺癌临床病理特征及E-cad表达的关系方法：通过IHC方法检测乳腺组织Sphk1蛋白表达情况，并分析其与乳腺癌临床病理特征及E-cad表达的关系。结果：Sphk1在乳腺癌中的表达高于在乳腺纤维腺瘤中表达(P=1.69×10^-11)；Sphk1与乳腺癌T分期（P=3.11×10-5）、Pn分期(P=9.22×10^-10)、ER表达（P=0.034）、HER-2表达（P=0.013）有关，而与患者年龄、月经状况、PR表达无关；可见E-cad（-）与Sphk1（+++）、E-cad（+++）与Sphk1（-）之间联系较为紧密，且两者分类之间存在负相关关系（P=1×10-13）；E-cad（-）且Sphk1（+）的淋巴结阳性例数高于E-cad（+）且Sphk1（-）(P=1.3592×10^-10)。2. Sphk1在MCF10-A细胞恶性转化中的作用及机制初步探讨方法：（1）通过DMBA诱导MCF-10A细胞，采取RT-PCR和Western-blot法检测诱导后细胞Sphk1及E-cad mRNA、蛋白表达水平变化，CCK-8法检测细胞增殖能力，Transwell法检测侵袭水平的变化，软琼脂克隆形成实验检测细胞非锚定依赖性生长能力；（2）通过慢病毒感染MCF-10A细胞过表达Sphk1，采取RT-PCR和Western-blot法检测Sphk1及E-cad的mRNA和蛋白表达水平，CCK-8法检测细胞的增殖能力，Transwell法检测细胞侵袭能力。（3）在转染过表达Sphk1的MCF-10A细胞中加入Sphk1激动剂TNF-α、Sphk1抑制剂DMS，采取RT-PCR和Western-blot法检测Sphk1及E-cad mRNA和蛋白表达水平，CCK-8法检测细胞的增殖能力，Transwell法检测细胞侵袭能力。结果：（1）DMBA诱导后第30代MCF-10A细胞Sphk1mRNA、蛋白表达水平较未诱导细胞明显升高，而E-cad明显减低；细胞增殖和侵袭能力明显升高；细胞在软琼脂上形成克隆，对照组细胞未能形成克隆。（2）慢病毒转染过表达后，MCF-10A-Sphk1组较MCF-10A组、MCF-10A-空质粒组细胞Sphk1mRNA和蛋白表达水平明显升高，增殖和侵袭能力明显升高。（3）慢病毒转染过表达后，MCF-10A-Sphk1细胞E-cad mRNA和蛋白表达水平明显降低，而TNF-α可增强Sphk1对E-cad表达的调节作用，DMS可阻断该作用。3.干扰Sphk1对MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响方法：通过siRNA干扰MCF-7细胞的Sphk1表达，采取RT-PCR和Western-blot法检测Sphk1及E-cad的mRNA和蛋白表达水平，CCK-8法检测细胞的增殖能力，Transwell法检测细胞侵袭能力。结果：转染siRNA后，MCF-7细胞Sphk1mRNA和蛋白表达水平均明显下降，而E-cad mRNA和蛋白表达水平均明显升高，MCF-7细胞增殖和侵袭能力明显下降。结论：1、Sphk1与乳腺癌恶性程度高、淋巴结转移等不良预后相关；2、DMBA能诱导MCF-10A细胞发生恶性转化，恶性转化后细胞的Sphk1表达水平明显上调，E-cad表达下调，细胞增殖侵袭能力增强；3、转染过表达Sphk1能使MCF-10A细胞呈现恶性表型，E-cad表达下调，细胞增殖侵袭能力增强；而Sphk1siRNA可上调MCF-7细胞E-cad表达，细胞增殖侵袭能力减弱；4、TNF-α/Sphk1/E-cad通路在乳腺癌侵袭过程中可能发挥重要作用。