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红曲是以红曲霉为主发酵菌所生产的一种独特的紫红色米曲,主要应用于黄酒酿造、食品发酵、色素生产和中医中药等方面。红曲霉是红曲的主发酵菌,前期研究发现,该菌可代谢合成辅酶Q10。十聚异戊烯焦磷酸合成酶(DPPS)是合成辅酶Q10的关键限制性酶,红曲霉DPPS编码基因的克隆及异源表达尚未见报道。本课题以前期筛选获得的辅酶Q10产生菌株(红曲霉N4-5)为研究对象,开展DPPS编码基因克隆、原核重组表达等方面的研究,以期揭示红曲霉辅酶Q10代谢合成的分子机制,为红曲资源的开发利用提供科学依据。本文主要研究了如下内容:1、优化确定了红曲中辅酶Q10含量的HPLC检测参数。色谱条件为:Shim-pack反相C18柱,250×4.6mn,5μm;紫外检测器,检测波长:275nm;柱温:35℃;进样体积:1OμL;流动相为无水乙醇-甲醇(1:1);流速:1.0mL/min。在上述色谱条件下15min内即可检测出样品中辅酶Q10的含量。该法简便、准确可靠、灵敏易操作。2、采用RT-PCR技术,从红曲霉中克隆出DPPS基因的全长cDNA,并进行了序列分析和功能预测。克隆获得的DPPS基因全长cDNA,全长1188bp,包含一个完整的开放阅读框(1176bp),编码392个氨基酸,其蛋白质分子量约为43.57kDa。在核苷酸水平上,红曲霉DPPS基因全长cDNA序列与黄曲霉IPP、米曲霉IPP和费氏新萨托菌DPPS分别有74%、74%、73%的同源性;在氨基酸水平上,红曲霉DPPS与费氏新萨托菌DPPS、黄曲霉IPP、米曲霉IPP的氨基酸序列分别有68%、68%、68%的相同性和79%、80%、80%的相似性。CDD和CDART数据库搜索结果表明:红曲霉DPPS与其他物种的DPPS一样都具有7个保守区域,其中包含了 2个天冬氨酸富含区:LXXDDXXDXXXRRG和GXXFQXXDDXXDXXXD,这是聚戊烯焦磷酸合成酶特征性保守区域。具有异戊烯转移酶家族的功能结构域。因此,推测DPPS具有十聚异戊烯焦磷酸合成酶基因的功能。3、对克隆获得的红曲霉DPPS进行原核重组表达、亲和层析纯化以及表达产物通过HPLC检测。将构建获得的DPPS原核表达载体pET-DPPS,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,目的基因成功表达出与预期大小一致的融合蛋白。进一步采用亲和层析法对DPPS的纯化进行了研究,结果表明His-DPPS融合蛋白可以通过镍亲和柱进行纯化,得到电泳纯度的目标蛋白。表达产物通过HPLC检测结果表明,DPPS是红曲霉合成辅酶Q10的关键酶。我们研究是红曲霉中首次对合成辅酶Q10侧链的关键酶的研究。4、以籼米为原料,优化富含辅酶Q10红曲固态发酵工艺。采用Box-Benhnken实验设计和响应面分析,以影响红曲色价和辅酶Q10含量的4个关键固态发酵条件(初始pH、接种量、初始含水率、亚油酸添加量)为自变量,以红曲色价和辅酶Q10含量为响应值对上述4个关键发酵条件参数进行优化,并在此基础上探讨红曲分段控温发酵策略。初始pH、接种量和亚油酸对红曲色价和辅酶Q10影响显著(P<0.05),而初始含水率对红曲色价和辅酶Q10影响不显著(P>0.05),优化确定红曲最佳发酵条件为:初始pH6.0,接种量12%,籼米初始含水率50%,亚油酸添加量64μM。辅酶Q10红曲固态发酵的温度控制策略为:30℃/6d←34℃/5d→28℃/4d。在最佳发酵工艺条件下,所制红曲的色价和辅酶Q10含量分别为4521.69U/g和387.23mg/kg,较优化前分别提高38.10%和80.01%。