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目的:(1)探索MALAT-1相关信号通路是否与急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)的发生、发展及预后具有相关性,从而揭示MALAT-1可能介导的表观遗传调控对急性髓细胞白血病发生、发展的影响。为急性髓细胞白血病诊断和治疗的进一步深入研究提供新的切入点。(2)进一步研究MALAT-1相关通路对白血病细胞株功能的影响,为今后探索靶向治疗某些类型急性白血病提供一定的研究基础。(3)细胞实验探讨MALAT-1可能与DNA和/或组蛋白修饰复合物相互作用,从而介导靶基因启动子区CpG岛和/或组蛋白的甲基化修饰,进而对急性髓细胞白血病的发生、发展产生影响。借助上述研究阐明MALAT-1及其相关通路介导的表观遗传调控的可能机制。方法:(1)以初治急性髓细胞白血病患者和正常人的骨髓单个核细胞为对象,利用RT-qPCR(Real-time Quantitative PCR)方法检测MALAT-1及PRC2复合体(EZH2、SUZ12、EED)相关蛋白编码基因的表达情况,对上述检测的急性白血病患者进行临床随访观察,分析MALAT-1是否参与急性白血病的发生、发展及预后。(2)在多种急性髓细胞白血病细胞株中鉴定MALAT-1的表达情况,根据临床标本RT-qPCR结果筛选部分类型的急性白血病细胞株为研究对象,构建MALAT-1干扰的慢病毒载体,感染细胞,分别利用CCK-8法绘制细胞生长曲线、克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期等方法检测白血病细胞株的增殖改变情况;利用苯并咪唑荧光染料(bisbenzimide,Hoechst 33258)染色法观察细胞凋亡的形态、Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测细胞的凋亡率、Western blotting法检测细胞株中凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达,了解细胞凋亡改变情况;同时通过Western blotting法检测MALAT-1沉默后对经典的Wnt/β-catenin细胞信号通路的影响。通过上述实验了解MALAT-1对白血病细胞功能的可能影响。(3)通过文献检索预测MALAT-1下游可能调节的靶基因,采用RT-qPCR法检测MALAT-1沉默后靶基因的表达情况。并采用焦磷酸测序法(Pyrosequencing method)检测靶基因启动子CpG岛甲基化修饰状况,分析其甲基化率的差异。同时采用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecitation,ChIP)结合qPCR法(ChIP-qPCR)检测白血病细胞株中靶基因启动子区相关组蛋白H3K27(histone H3 lysine 27)的甲基化修饰情况。采用RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)结合qPCR技术(RIP-qPCR)明确是否形成染色质修饰复合体。试图探究MALAT-1通路介导靶基因发生表观遗传调控修饰的可能机制。(4)采用RT-qPCR法检测靶基因在急性髓细胞白血病患者及正常人中的差异表达情况,同时采用焦磷酸测序法检测靶基因启动子CpG岛甲基化修饰的差异情况,进一步验证MALAT-1及其靶基因在急性白血病患者中的可能临床意义。(5)生物信息学预测靶向MALAT-1的microRNA,通过构建过表达目标microRNA的慢病毒载体,转染白血病细胞株,RT-qPCR法检测转染后MALAT-1的表达量,并检测前期MALAT-1沉默后的白血病细胞株中目标microRNA的表达量。同时通过双荧光素酶报告基因实验验证MALAT-1和目标microRNA两者之间的相互作用。结果:(1)与正常对照相比,AML患者MALAT-1出现异常的高表达,亚组分析显示M5患者的MALAT-1表达量增高,M5患者中MALAT-1高表达组的总生存时间(OS)较低表达组明显缩短。OS的单因素分析显示外周血白细胞计数(WBC)、MALAT-1的相对表达水平是预后指标,多因素分析显示MALAT-1的相对表达是影响患者OS的独立预后因素。(2)PRC2复合体相关亚基的编码基因EZH2和EED在初治AML患者中均较正常对照组高表达,SUZ12差异无统计学意义。亚组分析则提示EZH2、SUZ12、EED三者在M5患者中均表达增高,差异有统计学意义。相关性分析提示:M5患者中EZH2、SUZ12与MALAT-1的表达存在正相关,推测MALAT-1可能通过介导组蛋白的甲基化修饰参与白血病的发生。(3)根据临床标本及多种AML白血病细胞株的RT-qPCR结果,筛选出M5细胞株:U-937和THP-1细胞,作为下一步实验的研究对象。(4)成功构建GV248-MALAT-1-RNAi慢病毒载体,转染U-937及THP-1细胞株,采用RT-qPCR检测,转染结果显示:两种细胞株MALAT-1的表达量下调程度均大于50%(P<0.05),表明构建细胞模型成功。(5)利用CCK-8法绘制细胞生长曲线、克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期方法检测白血病细胞株的增殖情况,结果显示:沉默MALAT-1可明显抑制U-937及THP-1细胞的增殖,并导致细胞周期发生G0/G1期的阻滞。(6)Hoechst 33258荧光染色显示:MALAT-1沉默后,U-937和THP-1细胞出现凋亡增多,部分细胞核致密浓染,部分细胞核裂解为碎块,并产生凋亡小体;流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示U-937和THP-1细胞均出现凋亡率的明显增高。Western blotting法显示转染后的U-937、THP-1细胞株中凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达均发生上调。同时通过对经典的Wnt/β-catenin细胞信号通路的相关蛋白进行检测,结果显示:β-catenin及c-Myc蛋白均发生表达下调,提示MALAT-1可能通过经典Wnt/β-catenin信号通路影响U-937、THP-1细胞株的增殖。(7)通过文献检索的方法预测MALAT-1下游可能调节的靶基因(E-cadherin、PTEN)。(8)U-937、THP-1细胞株敲低MALAT-1后,RT-qPCR结果显示:E-cadherin、PTEN基因的表达发生上调,多个基因EZH2、SUZ12、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、C-Myc、β-catenin的表达均发生下调,EED表达变化无统计学差异。(9)焦磷酸测序法结果显示:U-937、THP-1细胞敲低MALAT-1后,E-cadherin、PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化率均出现不同程度下调。(10)ChIP-qPCR结果显示:敲低MALAT-1后,U-937、THP-1细胞株中靶基因E-cadherin、PTEN的启动子区组蛋白H3K27me3水平明显下降。(11)RIP-qPCR结果显示:U-937细胞中MALAT-1可以通过EZH2及SUZ12蛋白的相应抗体富集,与阴性对照组(IgG)相比差异均具有统计学意义,分别使用EED、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B抗体进行RNA免疫共沉淀分析时,与阴性对照组(IgG)比较,MALAT-1的富集均未检出明显差异。THP-1细胞上得到与U-937类似的结果。(12)RT-qPCR结果显示:与正常对照相比,M5患者PTEN及E-cadherin基因表达均发生下调。同时焦磷酸测序检测临床标本,结果显示:与正常对照相比,M5患者PTEN及E-cadherin基因启动子区的CpG岛的平均甲基化率明显升高,差异有统计学意义。(13)通过生物信息学网站(http://www.mircode.org/)搜索靶向MALAT1的miRNA,预测结果显示MALAT1 RNA链上共有105个miRNA结合位点,我们发现miR-143与MALAT1可能存在潜在的结合位点。我们成功构建过表达miR-143的慢病毒载体,转染至白血病细胞株,通过RT-qPCR法检测转染后MALAT-1的表达量,结果显示:与对照组相比,转染后U-937、THP-1细胞中MALAT-1均出现不同程度的表达下调。前期转染MALAT-1干扰病毒的白血病细胞miR-143的表达量无发生明显差异。进一步,我们成功构建了包含miR-143结合位点的MALAT-1片段的psiCHECK-2-MALAT-1双荧光素酶报告基因载体,并在293T细胞上进行报告基因验证,结果显示:过表达miR-143可使psiCHECK-2-MALAT-l野生型(psiCHECK-2-MALAT-l-WT)报告基因的荧光素酶活性降低,然而,将miR-143结合位点突变后,降低荧光素酶活性作用消失。说明miR-143可能通过MALAT-1的miR-143结合位点发挥调控作用。结论:(1)MALAT-1在M5患者中表达增高,且与M5的不良预后密切相关。M5患者中EZH2、SUZ12、EED表达明显增高,EZH2、SUZ12与MALAT-1的表达呈正相关,提示MALAT-1可能通过介导DNA和/或组蛋白的甲基化修饰参与急性髓细胞白血病的发生。(2)体外实验下调MALAT-1基因的表达,可以明显抑制U-937及THP-1细胞的增殖,并导致细胞周期发生G0/G1期的阻滞,同时可诱导细胞发生凋亡。(3)通过文献检索的方法筛选出MALAT-1下游可能调控的靶基因(E-cadherin、PTEN)。MALAT-1可能通过结合EZH2、SUZ12形成MALAT-1-PRC2复合体,诱导下游靶基因(E-cadherin、PTEN)组蛋白H3K27的三甲基化修饰,进而导致靶基因的转录沉默。MALAT-1可能通过影响DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达,诱导下游靶基因(E-cadherin、PTEN)的启动子区CpG岛甲基化修饰,从而调控靶基因的表达,其机制仍有待进一步研究。(4)生物信息学方法预测靶向MALAT-1的miR-143,miR-143可能通过结合MALAT-1序列上的结合位点发挥调控MALAT-1的作用。