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背景与目的目前胃癌的筛查性诊断主要依赖胃镜，但是胃镜为有创性检查，且费用较高，部分患者因恐惧而不愿接受胃镜检查。血清肿瘤标志物检测是简便易行的肿瘤筛查诊断方法，但目前仍缺乏有临床价值的胃癌标志物。适配子是一种生物分子的单链核酸配体，通过指数扩增的配体系统进化（SELEX）技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选获得，能高特异性、高亲和力结合靶分子，用于疾病诊断具有良好的应用前景。本课题组在前期研究中，以胃癌血清为靶标进行了10轮适配子筛选，克隆分离出一批适配子，其中部分适配子与胃癌混合血清的结合程度大于与正常混合血清，但对胃癌诊断价值并不理想。为此，本研究在前期筛选的基础上继续筛选特异性更好的适配子，然后进行基于适配子的胃癌诊断研究，为建立新的胃癌筛查性诊断新技术奠定基础。方法：1．血清标本收集及混合血清的制备：收集南昌大学第一附属医院2012-2013年间就诊的胃癌、非萎缩性胃炎、消化性溃疡病人和参加体检且各项检查均正常的健康人的血清标本，-80℃保存备用。随机取胃癌血清标本15例等量混合制备胃癌混合血清，同法制备正常混合血清。2．胃癌血清适配子的再筛选和分离：以前期第10轮胃癌血清适配子筛选后的亚文库继续进行SELEX筛选，并采用聚丙烯酰胺电泳逐轮监测亚文库条带的集中度和特异性，并据此确定筛选终点。选择与胃癌混合血清有特异性结合的适配子亚文库进行对称PCR扩增，送生物工程公司克隆测序，分离适配子。3．胃癌血清适配子的鉴定：采用RNAStructure4.6软件模拟分析所分离适配子的二级结构。选出二级结构少且自由能低的适配子进行人工合成，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度分析法先确定适配子与血清标本作用时两者的合适用量，再小样本血清标本鉴定适配子与胃癌血清结合的特异性，即将适配子分别与胃癌和正常血清标本各16例孵育、聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色，测定游离带的灰度值，计算其与适配子对照的比值。胃癌组灰度比值小于正常组且差异有统计学意义者为胃癌血清特异性适配子。4．荧光法评价适配子对胃癌的诊断价值：选出对胃癌血清有一定特异性的适配子，采用本课题组建立的荧光法来评价它们对胃癌的诊断价值。在确定适配子及血清的合适用量后，随机挑选胃癌、正常血清标本各15例，初步筛选对胃癌有诊断价值适配子。选择组间有差异且诊断胃癌的AUROC在0.9以上的适配子，荧光法小样本（胃癌、正常血清标本各32例）验证它们对胃癌的诊断价值。对小样本验证有价值的适配子再扩大样本（胃癌、良性胃病、正常血清各100例左右）确认它们对胃癌的诊断价值。同时以结合缓冲液代替适配子测定血清标本的本底荧光值。单独和联合分析适配子、血清本底荧光值诊断胃癌的AUROC和效能（敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比）。结果：1．胃癌血清适配子的再筛选和分离：再筛选过程中，电泳显示亚文库条带逐渐集中，与胃癌混合血清结合的特异性呈不断增强趋势，至第18轮时停止筛选。取第14～18轮的亚文库分别送公司克隆，共分离出160个适配子。2．胃癌血清适配子的鉴定：二级结构模拟分析显示所分离的适配子有丰富的二级结构，其中21个适配子的二级结构多样性少于2种。小样本血清标本鉴定显示，21个适配子中有11个的胃癌组游离条带灰度比值小于正常组，且组间差异有或接近有统计学意义（P<0.1），即胃癌血清特异性适配子。3．适配子对胃癌的诊断价值：将上述11个胃癌血清特异性适配子分别与胃癌、正常血清标本各15例孵育后测定荧光值，结果显示有3个适配子（AP-GCS-15-16、AP-GCS-16-17、AP-GCS-17-16）诊断胃癌的AUROC达到0.9以上。将这3个初筛对胃癌有良好诊断价值的适配子进行小样本验证（胃癌、正常血清各32例），结果显示适配子AP-GCS-15-16、AP-GCS-17-16诊断胃癌的AUROC均在0.7以上。对这2个适配子扩大样本（胃癌106例、良性胃病84例、正常血清94例）验证它们对胃癌的诊断价值，结果显示适配子AP-GCS-15-16的荧光值在胃癌组与良性胃病组和正常组均有统计学差异（P<0.001），而良性胃病组与正常组间无统计学差异（P>0.05），诊断胃癌的AUROC达到“良好”水平（0.880），敏感度为70.8%，特异度为84.9%，准确度为79.6%，但AP-GCS-17-16只有0.656。此外，血清本底荧光对胃癌的诊断价值有限，AUROC只有0.632。4．适配子联合分析对胃癌的诊断价值：联合分析可提高对胃癌的诊断价值。AP-GCS-15-16与血清本底荧光联合检测诊断胃癌的AUROC从0.880提高至0.920，敏感度为89.6%，特异度为81.5%，确准度为84.5%；AP-GCS-17-16与血清本底荧光联合检测诊断胃癌的AUROC从0.656提升至0.725；AP-GCS-15-16与AP-GCS-17-16联合分析诊断胃癌的AUROC为0.885，无明显提高。结论：（1）通过SELEX技术再筛选，成功获得一组胃癌血清适配子，其中部分适配子能与胃癌血清一定程度地特异性结合。（2）通过荧光法筛选出了对胃癌有诊断价值的适配子，其中适配子AP-GCS-15-16单用对胃癌有良好的诊断价值，与血清本底荧光联合检测可进一步提高其诊断价值。（3）胃癌血清的本底荧光值高于良性胃病和正常血清，但对胃癌的诊断价值有限，与适配子联合分析可提高其诊断价值。