柑桔属分泌囊的起源发育方式一直存在很大的分歧。而有关柑桔属果实分泌囊发育及其挥发油变化规律以及精油合成场所的研究也尚属空白。为了深入研究这些问题，本文运用石蜡切片和扫描电镜技术研究了广佛手CitrusmeallcaLvar．sarcodactylis(Noot．)Swingle花的分化和果实的发育；运用冷冻切片、半薄切片、超薄切片技术，研究了广佛手果实分泌囊的结构、发生和发育特点，以及分泌囊发育过程中的组织化学和超微结构变化；同时，利用挥发油含量测定方法对果实发育过程中挥发油含量的变化进行了详细分析。另外，还利用电镜酶细胞化学方法研究了分泌囊发育过程中果胶酶和纤维素酶以及精油合成过程中3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶的变化。这些研究为揭示广佛手果实发育与精油变化的关系以及分泌囊起源和发生的形态学本质、精油合成场所等提供了科学的依据。现将结果叙述如下： 1果实的发育及其挥发油的含量变化 广佛手自开花后不久，柱头就开始萎缩，而花柱不掉落继续发育。广佛手的子房发育成果实圆柱形的基部，而花柱发育成手指状的结构。这样，成熟果的上部呈多数手指状分裂，果皮甚厚，略绵质而爽脆，外果皮密布有分泌囊。这种果实形成方式在高等植物中甚属罕见。另外，广佛手的胚珠在果实发育过程中不继续发育，汁囊败育，故广佛手成熟果实中常无种子和肉瓢。 根据广佛手果实的发育情况，按照果实的颜色和大小(颜色为主)分为5个时期(顺次为l至5)：深绿色、浅绿色、浅黄色、金黄色、暗黄色。通过挥发油含量测定法进行分析，发现果实含油率最高为第1和第3时期，含油率的变化趋势呈现“s”型；而单果含油量在第3时期达到最高，第4时期次之。此时，分泌囊空腔为圆形、直径大约为300um、上皮细胞完整光滑。综合果实的大小和分泌囊的形态结构特点，第3时期和第4时期(即果实颜色为浅黄色和金黄色)为最佳的采收时期。这些研究结果为广佛手的适时采收及提高中药佛手干片的质量提供外部形态和内部结构指标。 2分泌囊的结构、分布及发生、发育方式 广佛手果皮上肉眼可看到很多呈疣状突起的亮点，其内部即为分泌囊。从成熟果实横切面观察，分泌囊排列为一圈，其大小不等(大约直径为100-450um)，分布的部位深浅不一。分泌囊起源于外果皮的一个表皮细胞和与其相对的表皮下细胞，这两个细胞相继进行不同方向的分裂，最终形成具有帽区和球区结构的成熟分泌囊。其中球区含有由卜2层扁平切向延长的上皮细胞包围的分泌腔，上皮细胞细胞质浓厚，仅具小液泡。上皮细胞外围又由5—8层更为扁平的鞘细胞包围，液泡化程度较上皮细胞的高；而帽区呈圆锥状，由薄壁细胞构成，与表皮细胞相连，果皮往往在此处发生内陷。 根据分泌囊发育过程中细胞形态的变化特点判断，分泌囊是以裂溶生方式发生，并可将分泌囊的发育过程分为四个阶段，即分泌囊原始细胞阶段、分泌囊胞间隙形成阶段、分泌囊空腔扩大阶段和分泌囊成熟阶段。为了进一步揭示广佛手分泌囊腔形成方式的本质，运用电镜细胞化学方法对分泌囊发育过程中果胶酶和纤维素酶的变化进行了研究，结果表明分泌囊在发育早期是裂生的，只有果胶酶反应产物集中在原始细胞的细胞壁中层。果胶酶的作用导致了由4—5个上皮细胞围绕的胞间隙形成。果胶酶的活性在胞间隙形成阶段达到顶峰，往后的阶段迅速降低直到消失。而在空腔扩大阶段的早期(空腔由5—8个上皮细胞围绕)，纤维素酶开始在细胞壁中尤其是在初生壁中积累。由于纤维素酶的活动，一些上皮细胞的细胞壁变薄，细胞开始降解。降解的过程由内向外离心式发生，并伴随有细胞明显的结构紊乱、细胞核消失和胞质溶解的现象。随着纤维素酶的增加，越来越多的细胞被降解导致空腔的进一步扩大。最后，当纤维素酶活性降低，降解过程彻底完成，被光滑完整的上皮细胞包围的空腔重新出现。据此，我们认为广佛手果实分泌囊空腔是以裂溶生的方式发生。同时，研究发现果胶酶和纤维素酶是由内质网合成产生的，这些酶通过内质网衍生小泡与质膜融合释放到细胞壁中。另外，一部分的酶可以暂时贮存在液泡中，后由液泡排出。本研究首次运用细胞化学定位技术证明广佛手分泌囊空腔是以裂溶生方式形成。此细胞化学方法的应用，为解决芸香科植物分泌囊的发生和发育问题提供了更为科学可行的技术和方法。 3分泌囊发育过程中的组织化学变化 在幼嫩的果实中分泌囊处于原始细胞阶段，淀粉粒主要集中在外果皮表皮下卜3层薄壁细胞中，有时成群分布，维管束周围也有大量的淀粉粒分布，而分泌囊的原始细胞团无淀粉粒分布。在分泌囊胞间隙形成阶段，只有少数的淀粉粒分布在鞘细胞中。空腔扩大阶段，鞘细胞中的淀粉粒增多，上皮细胞出现淀粉粒。分泌囊附近的维管束中分布大量的淀粉粒，体积也变大，并且维管束与分泌囊的鞘细胞之间有小的维管束连接。在成熟阶段，维管束周围的淀粉粒分布减少，而分泌囊的鞘细胞中淀粉粒数量更多，上皮细胞中淀粉粒增多。在分泌囊发育4个阶段的上皮细胞中，挥发油的数量由少变多，体积也由小变大。表明淀粉粒和挥发油具有密切的相互关系，淀粉粒可能为精油的合成提供前体，并通过维管束转运到分泌囊的鞘细胞和上皮细胞中。 4分泌囊发育过程中超微结构变化 在分泌囊原始细胞阶段，原始细胞中含较多的质体和线粒体。质体中缺乏完整的膜结构，形态各异。在质体和线粒体中、质体外膜及线粒体外膜可见到少量嗜锇滴。在分泌囊空腔形成以后，上皮细胞内质体数量增多，质体内所含淀粉粒也增加。质体外常见到内质网鞘包裹。质体上的嗜锇滴也增加。同时内质网的数量增加，并有嗜锇滴出现。细胞质中也有较大的嗜锇滴。在分泌囊成熟阶段，上皮细胞内各细胞器的数量逐渐减少，但质体仍很多，嗜锇滴也多。相反，线粒体变小，无嗜锇滴分布。说明随着分泌囊的发育，上皮细胞内质体的结构逐渐完善，质体的数量逐渐增多，而精油的合成能力也逐渐增强。 5精油的合成场所及分泌过程 利用常规电镜技术发现在分泌囊原始细胞阶段，嗜锇滴主要分布在质体和线粒体中。在分泌囊空腔形成以后，质体上的嗜锇滴数量增加，同时细胞质和内质网上也出现嗜锇滴。在分泌囊成熟阶段，质体上的嗜锇滴仍很多。质膜附近常有较多的嗜锇滴，内质网多与质膜相连。说明精油的合成是在质体、线粒体、内质网和细胞质中。为更准确的揭示精油的合成部位，首次利用细胞化学方法对精油合成过程中的一种早期关键酶——HMG—CoA合成酶进行定位。结果表明在分泌囊原始细胞阶段，酶活性首先出现在质体、线粒体、内质网和细胞质上。自分泌囊空腔形成后，质体、线粒体、内质网和细胞质中的酶活性逐渐增强。至分泌囊成熟阶段，酶活性达到最大。说明随分泌囊的发育进程，精油的合成能力逐渐增强。其中，质体是精油合成的主要细胞器，线粒体次之，内质网的合成作用最弱，细胞质也是精油合成的重要场所。这一结果与用常规电镜技术所得出的结果基本相似。 精油合成以后，以多种方式被分泌出质膜。一是通过内质网与质膜的融合将嗜锇滴排出质膜。二是嗜锇滴直接与质膜融合被排出。最后，质膜外的油滴通过细胞壁，进入分泌囊空腔中。另外，贮存在液泡中的油滴可以通过液泡膜与质膜的融合分泌到细胞壁中或通过细胞的破毁而进入到分泌囊空腔中。