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研究目的本研究在高脂饮食(high fat diet,HFD)喂养的基础上,探讨双酚A(bisphenol A,BPA)暴露对小鼠胰岛素敏感性与神经酰胺(ceramide,Cer)从头合成的影响,并使用丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase,SPT)抑制剂阐明Cer从头合成在BPA暴露HFD喂养小鼠诱导胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的具体作用。研究方法3周龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级野生型雄性C57BL/6小鼠适应性喂养7天后,随机分为5组:正常饮食(normal control diet,NCD)组、HFD组、HFD+1000 n M BPA组、HFD+SPT抑制剂组、HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组,每组12只小鼠,8周和16周时间点各6只。小鼠经饮水暴露于BPA。使用SPT抑制剂组,小鼠每两天1次经腹腔注射0.3 mg/kg多球壳菌素,8周组在BPA暴露第5-8周进行,16周组在第13-16周进行,各15次。第8周和16周时,小鼠尾端采血,实施胰岛素耐受性测试(Insulin tolerance test,ITT)和葡萄糖耐量测试(glucose tolerance tests,GTT),测定空腹血糖(Fasting blood glucose,FG),麻醉后经眼球采血,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清胰岛素(Fasting blood insulin,FI)含量,用稳态模型评估法(homeostasis model assessment,HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。然后颈椎脱臼处死,无菌取附睾脂肪组织,部分用于组织病理学(histopathologic,HP)观察组织病理变化和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测炎症因子IL-1β、TNF-α表达情况。部分用于超高效液质联用(UPLC-MS)检测Cer的含量,Western Blot检测Cer从头合成以及胰岛素信号通路相关分子蛋白表达,以及RT-PCR检测Cer从头合成相关基因SPTLC1、SPTLC2 mRNA的表达。结果1小鼠一般情况实验期间,各组小鼠生长发育良好。相同时间点不同组小鼠每周平均饮水量和食物消耗量差异无统计学意义(P>0.05)。2 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养不同时间点小鼠体重的影响2.1 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养8周时小鼠体重的影响与NCD组相比,HFD组小鼠体重无统计学差异(P>0.05),而HFD+1000 n M BPA组小鼠体重从暴露第5周开始明显升高(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+1000n M BPA组小鼠体重无统计学差异(P>0.05)。SPT抑制剂可抑制小鼠体重,与HFD组相比,HFD+SPT抑制剂组小鼠体重在第8周明显下降(P<0.05);而HFD+1000n M BPA+SPT抑制剂组小鼠体重从第7周开始差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养16周时小鼠体重的影响与NCD组相比,HFD组小鼠体重从第9周开始显著上升(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 n M BPA组小鼠体重从第14周开始明显升高(P<0.05);SPT抑制剂可抑制小鼠体重,与HFD组相比,HFD+SPT抑制剂组小鼠体重从第15周开始下降(P<0.05);而HFD+1000n M BPA+SPT抑制剂组小鼠体重从第15周开始差异具有统计学意义(P<0.05)。3 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪垫系数的影响与NCD组相比,HFD组小鼠附睾脂肪垫系数8周组与16周组均升高(P<0.05)。与HFD组相比,8周组与16周组的HFD+1000n M BPA组小鼠附睾脂肪垫系数均明显增加,HFD+SPT抑制剂组小鼠两个时间点附睾脂肪垫系数均显著下降(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000n M BPA+SPT抑制剂组小鼠附睾脂肪垫系数下降,8周组与16周组均具有统计学差异(P<0.05)。不同时间点同组相比,HFD组、HFD+1000 n M BPA组小鼠附睾脂肪垫系数16周组明显高于8周组(P<0.05)。4 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠FG、FI和HOMA-IR的影响与NCD组相比,HFD组小鼠FG、FI与HOMA-IR水平8周组与16周组均升高(P<0.05)。与HFD组相比,8周组与16周组的HFD+1000 n M BPA组小鼠FG、FI与HOMA-IR水平均明显增加,HFD+SPT抑制剂组小鼠两个时间点的FG、FI与HOMA-IR水平均显著下降(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000n M BPA+SPT抑制剂组小鼠FG、FI与HOMA-IR水平在8周组与16周组均明显降低(P<0.05)。5 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠GTT、ITT的影响分别在第8周和第16周时对小鼠进行GTT测试。两个时间点,小鼠注入葡萄糖后时各组小鼠血糖浓度均快速增长,并在15 min左右上升到最大值,之后逐渐降低,在葡萄糖注射120 min时NCD组、HFD+SPT抑制剂组、HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠血糖浓度均恢复到基线水平,而HFD组、HFD+1000 n M BPA组血糖浓度仍高于基线水平。与NCD组相比,HFD组小鼠GTT的AUC在两个时间点均升高(P<0.05)。与HFD组相比,8周组和16周组的HFD+1000 n M BPA组小鼠GTT的AUC均明显上升,而HFD+SPT抑制剂组小鼠GTT的AUC在两个时间点均显著下降(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠GTT的AUC在8周组和16周组均降低(P<0.05)。分别在第8周和第16周时对小鼠进行ITT测试。两个时间点,小鼠在注入胰岛素后,血糖浓度均迅速下降,并在30 min左右下降到最低值,之后逐渐回升,在胰岛素注射120 min时NCD组、HFD+SPT抑制剂组、HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠血糖浓度均恢复到基线水平,而HFD组、HFD+1000 n M BPA组血糖浓度仍高于基线水平。与NCD组相比,HFD组小鼠ITT的AUC在8周组和16周组均增加(P<0.05)。与HFD组相比,两个时间点的HFD+1000 n M BPA组小鼠ITT的AUC均明显增加,而HFD+SPT抑制剂组小鼠在8周组和16周组ITT的AUC显著下降(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠ITT的AUC在8周组和16周组均下降(P<0.05)。6 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中炎性细胞浸润的影响8周组和16周组的HFD组小鼠脂肪细胞大小明显大于NCD组,且脂肪组织中细胞间隙炎性介质浸润明显加重。与HFD组相比,8周组和16周组的HFD+1000n M BPA组小鼠脂肪组织中细胞间隙炎性介质浸润均明显加重,HFD+SPT抑制剂组小鼠在8周组和16周组脂肪细胞大小均明显减小,脂肪组织中细胞间隙炎性介质浸润显著降低。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠两个时间点的脂肪细胞大小、脂肪组织中细胞间隙炎性介质浸润均明显降低。不同时间点同组相比可知,HFD组和HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织中细胞间隙炎性介质浸润16周组比8周组更严重,而NCD组、HFD+SPT抑制剂组、HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠炎性介质浸润无明显差异。7 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中炎性因子表达的影响与NCD组相比,HFD组小鼠脂肪组织炎症因子IL-1β、TNF-α表达增加,8周组与16周组平均累积光密度值(IOD)均升高(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织炎性因子IL-1β、TNF-α表达上调,HFD+SPT抑制剂组小鼠炎性因子IL-1β、TNF-α表达显著下调,8周组与16周组IOD值均存在统计学差异(P<0.05)。HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠两个时间点的脂肪组织炎性因子IL-1β、TNF-α表达均明显低于HFD+1000 n M BPA组(P<0.05)。不同时间点同组相比,HFD组、HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织炎性因子IL-1β、TNF-α表达16周组比8周组更严重,而NCD组、HFD+SPT抑制剂组和HFD+1000n M BPA+SPT抑制剂组脂肪组织炎性因子IL-1β、TNF-α表达的IOD值无明显差异(P<0.05)。8 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织Cer从头合成关键酶SPTLC1、SPTLC2蛋白表达的影响各组小鼠脂肪组织SPTLC2蛋白表达在两个时间点无统计学差异(P>0.05)。与NCD组相比,HFD组小鼠脂肪组织SPTLC1蛋白表达在8周组和16周组均明显上调(P<0.05)。与HFD组相比,8周组和16周组的HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织SPTLC1蛋白表达均显著上调,HFD+SPT抑制剂组小鼠两个时间点脂肪组织SPTLC1蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织SPTLC1蛋白表达在8周组和16周组均明显降低(P<0.05)。9 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织SPTLC1、SPTLC2 mRNA表达水平的影响各组小鼠脂肪组织SPTLC2 mRNA表达在8周和16周时无统计学差异(P>0.05)。与NCD组相比,HFD组小鼠脂肪组织SPTLC1 mRNA表达上调,16周组具有统计学差异(P<0.05)。与HFD组相比,8周组和16周组的HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织SPTLC1 mRNA表达均显著上调,HFD+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织两个时间点的SPTLC1 mRNA表达均明显下调(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织SPTLC1 mRNA表达8周组和16周组均降低(P<0.05)。10 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织Cer含量的影响C16 Cer(d18:1/16:0)、C17 Cer(d18:1/17:0)、C18 Cer(d18:1/18:0)、C20 Cer(d18:1/20:0)、C24:1 Cer(d18:1/24:1(15Z))和C24 Cer(d18:1/24:0)出锋时间依次为5.00s、5.22s、5.43s、5.82s、6.21s、6.71s。与NCD组相比,HFD组小鼠脂肪组织C16 Cer(d18:1/16:0)、总Cer含量在8周组和16周组均升高(P<0.05),而C20 Cer(d18:1/20:0)含量在16周组具有统计学差异(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+1000n M BPA组小鼠脂肪组织C16 Cer(d18:1/16:0)、C24:1 Cer(d18:1/24:1(15Z))和C24Cer(d18:1/24:0)、总Cer含量两个时间点均上升(P<0.05),而C20 Cer(d18:1/20:0)含量在16周组具有统计学差异(P<0.05),HFD+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织两个时间点的各种类Cer以及总Cer含量均明显下降(P<0.05)。与HFD+1000 n M BPA组相比,HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织各种类Cer以及总Cer含量在8周组和16周组均降低(P<0.05)。11 SPT抑制剂对BPA暴露HFD喂养小鼠附睾脂肪组织胰岛素信号通路蛋白表达的影响8周和16周时各组小鼠脂肪组织IRS1、PI3K、AKT表达水平无明显差异(P>0.05)。与NCD组相比,HFD组小鼠脂肪组织IRS1、PI3K、AKT磷酸化程度在8周组和16周组均降低(P<0.05)。与HFD组相比,8周组和16周组的HFD+1000 n M BPA组小鼠脂肪组织p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表达水平显著下调,HFD+SPT抑制剂组小鼠两个时间点的脂肪组织p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表述水平明显升高(P<0.05)。8周组和16周组的HFD+1000 n M BPA+SPT抑制剂组小鼠脂肪组织p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表达明显高于HFD+1000 n M BPA(P<0.05)。结论1.长期低剂量BPA暴露促进HFD喂养小鼠体重增加,加剧脂肪组织炎症细胞浸润,上调促炎细胞因子IL-1β、TNF-α表达。2.长期低剂量BPA暴露降低HFD喂养小鼠胰岛素敏感性,上调SPTLC1表达,增加Cer从头合成,导致脂肪组织Cer积累。3.SPT抑制剂下调小鼠脂肪组织SPTLC1蛋白表达,抑制Cer从头合成,逆转BPA暴露HFD喂养小鼠诱导的IR,改善葡萄糖耐受不良,增强胰岛素敏感性。