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癌症已成为目前危害人类健康的主要疾病之一,如何有效治疗癌症已成为世界性的难题。自RNA干扰现象被发现以来,如今涉及小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)的药物研发取得了很大进展。si RNA与化疗药物联合用药能在逆转肿瘤耐药性的同时,降低化疗药物的使用量并降低其毒副作用,给癌症的治疗带来了新的曙光。但是si RNA作为核酸类生物大分子,在递送过程中存在不易被细胞摄取且易被体内的核酸酶降解等问题,因此需要开发出一种安全有效的递送方法,从而将si RNA高效输送到肿瘤细胞中。纳米技术的发展为si RNA相关抗肿瘤药物的设计提供了新思路。作为si RNA的递送载体,纳米颗粒可以通过增强渗透滞留效应富集到肿瘤部位,从而高效地将si RNA输送到肿瘤细胞并发挥其抑制基因表达的作用。目前应用较为广泛的si RNA递送载体中,聚合物纳米颗粒具有较高的结构完整性和稳定性,能稳定的储存药物并控制药物的释放,但是也存在导致非特异性吸附的不足。脂质体纳米颗粒具有较好的生物相容性,但是易被网状内皮系统吞噬,且不能稳定储存药物。这些问题都限制了其临床应用,因此si RNA的递送给药是目前si RNA药物临床应用的最大挑战。本研究分别构建了两种不同的用于si RNA递送给药的纳米载体和输送系统,这两种系统均可高效将si RNA递送到肿瘤细胞中,显著抑制小鼠肿瘤的生长。研究工作分为如下两个部分。实验一:为了解决聚合物纳米颗粒和脂质体的缺点,本研究拟设计并优化出一种脂质-聚合物复合纳米颗粒,该颗粒具备脂质体和聚合物纳米颗粒的双重优点,既具有较好的生物相容性和生物利用度,同时具有较高的结构完整性,能更高效的存储药物并实现药物的控制释放。此外脂质-聚合物复合纳米颗粒的聚合物内核和磷脂外壳能分别装载疏水及亲水性药物,在提高药物包封率的同时,还能有效实现联合用药。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,Jnk)是促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族成员,又被称为应激活化蛋白激酶(Stress-activated kinases,SAPK),Jnk在传导胞外信号至核转录因子时起着重要作用,可以提高转录能力。有研究报道,在多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中均出现了Jnk的过度活化,表明Jnk有可能参与了肿瘤的形成过程。有研究进一步发现,Jnk可以促进前列腺癌的生长,在前列腺癌PC-3细胞中抑制Jnk-1表达,能够通过下调Bcl-2、survivin、p21Waf1和X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表达促进PC-3细胞凋亡。综上所述,本实验的研究思路是设计并优化出脂质-聚合物复合纳米颗粒PEG-LP,并将小干扰RNA(si Jnk-1)负载到纳米颗粒中,构建PEG-LP/si Jnk-1复合纳米颗粒,并在前列腺癌DU145细胞系和荷瘤鼠肿瘤模型中验证其治疗效果。实验目的:(1)设计出一种脂质-聚合物复合纳米颗粒,优化出合适的脂质/聚合物比例用于si RNA的系统给药,(2)将si Jnk-1负载到纳米颗粒中,构建PEG-LP/si Jnk-1复合纳米颗粒,检测该系统其对前列腺癌DU145细胞系和荷瘤鼠肿瘤模型的治疗效果。(3)对复合纳米颗粒PEG-LP/si Jnk-1诱导DU145细胞凋亡的机制进行初步探讨。实验步骤:选用DSPE-PEG和PLGA为载体材料,制备脂质-聚合物复合纳米颗粒用作si RNA输送载体,并优化出合适的脂质/聚合物比例;进一步研究这种复合纳米颗粒被肿瘤细胞的摄取以及抑制Jnk-1基因表达的能力;同时建立了裸鼠前列腺癌模型并进一步考察尾静脉注射脂质-聚合物复合纳米颗粒后的抑瘤效果。实验结果:在阳离子脂质的帮助下,复合纳米颗粒能高效包裹si RNA,动态光散射检测显示制备的纳米颗粒的粒径在120nm左右。体外细胞实验结果发现复合纳米颗粒能够有效将si RNA转染进前列腺癌DU145细胞,抑制Jnk-1基因的转录和表达,并可能是通过线粒体/细胞色素C调控的内在途径诱导前列腺癌DU145细胞的凋亡。体内实验中,在裸鼠前列腺癌模型中经尾静脉注射上述纳米颗粒后,通过测量裸鼠体重、肿瘤体积等变化,发现复合纳米颗粒PEG-LP/si Jnk-1能够抑制肿瘤的生长。经HE切片分析各组裸鼠组织器官的病理变化,发现复合纳米颗粒PEG-LP/si Jnk-1对裸鼠的主要器官没有造成明显的组织病变。结论:我们成功构建了可用于体内递送si RNA的复合纳米颗粒系统,该系统负载si Jnk-1后,体外和体内实验均表明对前列腺癌有治疗效果且无明显的副作用。实验二:Fe3O4纳米颗粒由于具有较好的生物相容性,能够用于体内核磁成像等功能被广泛应用于临床前研究。最近,研究发现多巴胺(Polydopamine,PDA)包被的Fe3O4具有较强的近红外吸收和高的光热转换能力,荷瘤小鼠经光热治疗后能够抑制肿瘤生长。聚多巴胺的合成方法简单,能够通过无毒的多巴胺单体直接聚合而成。而且,PDA表面具有许多功能基团(如邻苯二酚、氨基、羟基等),具有良好的亲水性和化学反应活性,能够方便地进行活性分子、抗体、核酸和抗肿瘤药物等的修饰和负载。同时PDA还具有良好的生物相容性,这使其在生物体内被广泛用作酶、抗体、核酸及药物的载体等。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)能够通过化学趋化和细胞间表面接触靶向肿瘤细胞,并且其肿瘤细胞靶向功能为肿瘤特异性靶向,因此可以利用间充质干细胞膜修饰纳米颗粒,提高纳米颗粒在体内的肿瘤靶向能力和延长其血液循环时间。目前国内外对细胞膜修饰的纳米载体的应用研究较少。随着对兼具生物体内长循环时间和肿瘤靶向功能的细胞膜纳米载体的制备、研究及应用,细胞膜修饰的纳米运输载体有可能成为未来纳米载体研究的主要方向。Polo样激酶1(Polo-like kinase1,Plk1),是一种广泛存在于真核生物中的丝/苏氨酸蛋白激酶,在大多数肿瘤细胞中高表达。研究表明抑制Plk1的表达后,能有效抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导肿瘤细胞的凋亡,提示Plk1是一种有效的肿瘤基因治疗靶点。综上所述,我们本实验的研究思路是先构建Fe3O4和PDA的复合纳米颗粒Fe3O4@PDA;该复合纳米颗粒可负载si RNA;再基于细胞膜融合技术,利用人脐带来源的间充质干细胞制备细胞膜囊泡,并用此细胞胞膜囊泡包裹负载si RNA的Fe3O4@PDA纳米颗粒,制备出Fe3O4@PDA-si RNA@MSCs复合纳米颗粒;然后对Fe3O4@PDA-si RNA@MSCs复合纳米颗粒结构、负载si RNA的能力、在体外的肿瘤趋向能力和光热转换效率等进行研究;最后将小干扰RNA(si Plk-1)负载到该系统,验证该系统在DU145细胞系和荷瘤裸鼠实验中的治疗效果。实验目的:(1)基于细胞膜融合技术,利用人脐带来源的间充质干细胞制备细胞膜囊泡,并用此细胞胞膜囊泡包裹具备负载si RNA能力的Fe3O4@PDA纳米颗粒,制备出Fe3O4@PDA-si RNA@MSCs复合纳米颗粒。(2)对复合纳米颗粒Fe3O4@PDA-si RNA@MSCs的结构、负载si RNA的能力、在体外的肿瘤趋向能力和光热转换效率进行了研究。(3)验证Fe3O4@PDA-si RNA@MSCs纳米颗粒在体外沉默靶基因Plk1的能力以及体内核磁成像和抗肿瘤效果。实验步骤:首先合成PDA包被的Fe3O4构建复合纳米颗粒Fe3O4@PDA,随后si RNA通过π-π堆积作用负载到多巴胺的表面,利用细胞膜融合技术将间充质干细胞膜与负载si RNA的Fe3O4@PDA纳米颗粒复合作为si RNA输送载体。由于间充质干细胞具有肿瘤趋向能力,使得复合材料既可以避免被免疫系统清除又具有肿瘤靶向识别能力。通过动态光散射仪、透射电镜等仪器对制备的纳米颗粒进行一系列表征观察。在进一步的实验中,将si Plk-1负载到该系统,验证该系统在DU145细胞系和荷瘤裸鼠实验中的治疗效果。实验结果:制备的复合纳米颗粒为球形,平均水合粒径大约为109 nm左右;稳定性实验显示复合纳米颗粒的血清稳定性和长期储存稳定性良好,14d内粒径无明显变化,在激光共聚焦显微镜下观察,干细胞膜包被纳米颗粒具有较好的核-壳结构。体外细胞实验结果显示,复合纳米颗粒能够有效将si RNA转染进前列腺癌DU145细胞,从m RNA和蛋白水平抑制靶基因Plk1的表达,并能诱导前列腺癌DU145细胞的凋亡。体内实验结果表明,在裸鼠前列腺癌模型中尾静脉注射上述纳米颗粒,通过光热治疗与基因治疗的协同作用,和对照组相比,对肿瘤有明显的抑制作用(P<0.05)。经HE切片分析发现Fe3O4@PDAsi Plk1@MSCs加光热治疗组裸鼠的主要器官与对照组裸鼠相比,没有明显的组织病变,说明复合纳米颗粒Fe3O4@PDA-si Plk1@MSCs在裸鼠体内没有全身毒性。结论:该系统能够提高纳米颗粒的肿瘤靶向能力,不但具有良好的生物相容性和长期稳定性,而且体外具有良好的光热转换能力及核磁成像能力。该系统负载si Plk-1后,结合光热治疗能有效地抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,且对裸鼠无明显的毒副作用,说明干细胞膜包被纳米颗粒在肿瘤的靶向治疗领域具有潜在的应用价值。