背景和目的：食管癌是人类常见的恶性肿瘤，具有高发生率和高致死率的特征。食管癌主要分为两类：食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EA）与食管鳞癌（esophageal squamouscell carcinoma, ESCC）。其中，食管鳞癌是我国食管癌的主要组织学类型。目前食管癌的疗效和预后很差，5年总体生存率仅为15％～25％。因此，研究其发病机制，寻找早期诊断及治疗的靶点具有重要意义。食管鳞癌是上皮来源的一类恶性肿瘤，其高侵袭性和高转移率是难以有效治疗的主要原因，不少患者经食管癌切除术后常发生转移与复发。目前已证实，上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤发生浸润和转移的起始步骤，与预后不良密切相关。目前食管癌发生EMT的机制尚不十分清楚。既往研究发现，多种转录因子均可参与调节EMT进程，如β-catenin、ZEB1、ZEB2、snail、slug、twist等。然而在不同类型的肿瘤中，调节EMT的关键因子差异很大。因此，寻找特异性调控食管癌EMT和转移的关键分子显得尤为重要。转录因子CCAAT/增强子结合蛋白beta（CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBPβ）也称作核因子白细胞介素-6（nuclear factor for IL-6，NF-IL6），能调节细胞增殖与分化，参与炎症反应、脂肪发生和肿瘤发生等重要生命活动。C/EBPβ mRNA通过核糖体跳跃机制可选择性翻译成3种蛋白异构体：LAP1（Liver-enrichedtranscriptional activator protein）、LAP2和LIP （Liver-enriched transcriptional inhibitoryprotein）。LAP1和LAP2通常可作为转录激活因子，而LIP通常是转录抑制因子。近年研究表明，C/EBPβ的表达失调与多种肿瘤恶化密切相关，如胶质瘤、Wilms瘤、肾细胞瘤、卵巢癌等。将过表达C/EBPβ LAP2蛋白的重组逆转录病毒感染人乳腺上皮MCF10A细胞可诱发EMT与侵袭表型。然而，C/EBPβ LAP2以何种机制启动EMT以及C/EBPβ是否参与食管癌细胞EMT等问题有待研究。微小RNA（microRNA，miRNA）是最近发现的一类非编码RNA，在肿瘤的发生发展等病理生理进程中发挥重要作用。已有研究证实，miR-203是一种抑癌基因样的miRNA分子，在多种肿瘤中具有抑制EMT和转移的功能。miR-203在肿瘤中的低表达具有普遍性，目前已有多个研究小组在食管癌组织中观察到miR-203基因的表达降低。我们前期研究发现，在食管鳞癌组织与远癌组织中miR-203启动子区CpG岛均处于非甲基化状态，提示食管癌鳞中miR-203的表达下调并非由DNA甲基化状态改变所引起。因此，miR-203在食管鳞癌中表达下降的机制仍有待研究。利用生物信息学分析发现，miR-203基因启动子区具有两个保守的C/EBPβ结合位点，提示miR-203可能受到C/EBPβ的调控。既往研究表明，C/EBPβ对下游靶基因可发挥转录激活和转录抑制的双重作用，那么C/EBPβ将以何种方式调控miR-203的表达及相应机制是什么？另外，C/EBPβ是否通过调控miR-203参与食管癌EMT与转移进程？除EMT之外，肿瘤细胞的异常增殖与凋亡也是肿瘤恶化的重要生物学特征。细胞增殖和凋亡平衡失调是肿瘤发生发展过程中的普遍现象。以往的研究表明，C/EBPβ参与调控多种肿瘤细胞如肝癌、胶质瘤及多发性骨髓瘤等的增殖与凋亡进程。然而，C/EBPβ是否影响食管癌细胞增殖和凋亡尚不清楚。研究报道，miR-146b与肿瘤细胞的增殖与凋亡相关。在食管癌中，miR-146b是一种癌基因样的miRNA。miRNA表达谱分析显示，miR-146b在食管癌组织中高表达并与患者总体生存率差相关。然而，miR-146b在食管癌细胞增殖、凋亡中的功能以及miR-146b在食管癌组织中表达上调的具体机制有待研究。生物信息学分析结果显示，miR-146b基因启动子区具有两个保守的C/EBPβ结合位点，提示miR-146b可能受到C/EBPβ的调控。然而，C/EBPβ调控miR-146b的方式及具体机制是什么？此外，C/EBPβ是否通过调控miR-146b的表达影响细胞增殖与凋亡进程？本研究拟检测食管鳞癌组织样本中C/EBPβ的蛋白表达情况，并比较与淋巴结转移等临床病理参数的相关性以了解C/EBPβ的表达意义。体外实验证实C/EBPβ是否参与食管鳞癌细胞EMT、迁移、侵袭、增殖和凋亡等生物学行为以明确C/EBPβ的功能意义。进一步探讨C/EBPβ对miR-203和miR-146b的调控作用以理解C/EBPβ参与肿瘤发生发展进程的分子机制。研究方法与内容：1.检测C/EBPβ在食管鳞癌组织中的表达。1.1采用Western Blot方法检测了36对食管鳞癌组织以及配对远癌组织中C/EBPβ的蛋白表达情况，并分析其表达与临床病理参数的关系。1.2采用免疫荧光方法观察食管鳞癌组织和远癌组织中C/EBPβ与vimentin的表达关系。2. C/EBPβ在食管癌细胞EMT、迁移和侵袭中的功能。2.1EGF诱导食管癌细胞EMT模型的建立以及C/EBPβ表达变化。EGF处理食管癌细胞株EC109和EC9706后，光学显微镜下观察形态学变化；Western Blot检测ZO-1，pan-cytokeratin，β-catenin，vimentin等EMT标志基因以及C/EBPβ的蛋白表达；RT-qPCR法检测C/EBPβ的mRNA表达水平。2.2C/EBPβ对食管癌细胞EMT、迁移和侵袭的影响。2.2.1在EGF诱导食管癌细胞EMT模型中转染C/EBPβ siRNA，Western Blot法检测EMT标志蛋白表达，免疫荧光法观察细胞形态学变化。2.2.2将C/EBPβ真核表达质粒（pcDNA3-LAP1、pcDNA3-LAP2、pcDNA3-LIP）转染食管癌细胞，Western Blot法检测EMT标志蛋白的表达，Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。3. C/EBPβ LIP促进食管癌细胞EMT、迁移和侵袭的分子机制研究。3.1C/EBPβ LIP通过miR-203介导食管癌细胞EMT和促进细胞迁移及侵袭。分别在EC109细胞中过表达pcDNA3-LIP真核表达质粒与化学合成的miR-203inhibitor，Western blot检测EMT标志蛋白表达。将pcDNA3-LIP真核表达质粒与miR-203mimic共转染食管癌EC109细胞后，transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。3.2C/EBPβ LIP抑制miR-203表达的分子机制。3.2.1C/EBPβ LIP对miR-203表达的影响。EGF处理食管癌EC109和EC9706细胞24小时后RT-qPCR法检测miR-203的表达情况。沉默C/EBPβ后再用EGF处理24小时，RT-qPCR法检测miR-203及下游靶基因的表达水平。正常培养条件下转染不同剂量的pcDNA3-LIP真核表达质粒，24小时后RT-qPCR法检测miR-203的表达水平。3.2.2ChIP、EMSA检测miR-203基因转录起始位点上游调控区C/EBPβ结合情况。ChIP检测EGF诱导后以及沉默C/EBPβ后miR-203基因调控区组蛋白修饰情况以观察染色质凝聚状态。3.2.3双荧光素酶报告基因试验检测C/EBPβ LIP对miR-203转录活性的影响。4.将食管癌细胞分别转染C/EBPβ表达质粒与miR-146b mimics，EdU染色法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率以观察C/EBPβ和miR-146b对食管癌细胞增殖和凋亡的影响。5. C/EBPβ对miR-146b的调控机制。5.1C/EBPβ对miR-146b基因表达的影响。将pcDNA3-LAP1、pcDNA3-LAP2和pcDNA3-LIP真核表达质粒以及阴性对照pcDNA3.1质粒转染食管癌EC109细胞后RT-qPCR法检测miR-146b表达。5.2ChIP方法检测miR-146b基因转录起始位点上游调控区C/EBPβ结合情况。5.3双荧光素酶报告基因试验检测C/EBPβ LAP2对miR-146b转录活性的影响。结果：1.食管癌组织中C/EBPβ LIP表达上调及LIP/LAP比例失衡与淋巴结转移相关；C/EBPβ与vimentin具有共表达关系，提示C/EBPβ异常表达可能参与食管癌细胞EMT和侵袭转移等进程。2.在正常培养条件下，食管鳞癌细胞株EC109和EC9706呈现典型的鹅卵石状多边形的上皮样细胞表型。EGF（50ng/ml）诱导使细胞表型发生明显改变，包括较为分散的生长模式，细胞呈现纺锤形的形态。与对照组比较，EGF显著降低了ZO-1，pan-cytokeratin等上皮标志蛋白表达水平，显著增加了β-catenin，vimentin等间质标志蛋白表达水平，说明体外诱导食管癌细胞EMT的模型成功建立。在EGF诱导食管癌细胞EMT模型中，C/EBPβ蛋白与mRNA表达水平均显著增加。3.在EGF诱导食管癌细胞EMT模型中，干扰C/EBPβ能显著上调ZO-1，pan-cytokeratin等上皮标志蛋白表达，下调β-catenin，vimentin等间质标志蛋白表达。过表C/EBPβ LIP能以剂量依赖的方式显著改变上述EMT标志蛋白表达水平。而过表达C/EBPβ LAP1和C/EBPβ LAP2不能改变EMT标志蛋白表达。提示C/EBPβ LIP对食管癌细胞发生EMT起关键作用。4.与对照组比较，过表达C/EBPβ LIP组迁移和侵袭细胞数量明显增加。提示C/EBPβ LIP能促进食管癌细胞迁移和侵袭。5.在EGF诱导食管癌EMT模型中，沉默C/EBPβ可上调上皮标志蛋白ZO-1、pan-cytokeratin，下调间质标志蛋白β-catenin、vimentin，从而抑制EMT；在沉默C/EBPβ基础上，加入miR-203inhibitor能逆转该效应，表现为下调上皮标志蛋白ZO-1、pan-cytokeratin，上调间质标志蛋白β-catenin、vimentin，从而促进EMT。说明C/EBPβLIP介导EMT的作用与miR-203相关。6.过表达pcDNA3-LIP质粒能显著增加细胞迁移和侵袭数量；在此基础上过表达miR-203mimic后细胞迁移和侵袭数量减少，说明miR-203mimic能够逆转C/EBPβ LIP促进细胞迁移和侵袭的效应。7. EGF处理食管癌细胞后miR-203表达下调；干扰C/EBPβ能减弱EGF对miR-203表达的抑制作用并下调miR-203下游基因E2F1、BIRC5、snail、slug表达水平。在正常培养食管癌细胞中过表达C/EBPβ LIP能以剂量依赖的方式抑制miR-203表达水平。8.生物信息学分析发现，miR-203转录起始位点上游5KB范围内的调控区域内有两个C/EBPβ结合位点，分别位于-3628/-3615（203R1）和-3266/-3253（203R2）区域。ChIP实验结果显示，EGF处理后，C/EBPβ与203R1和203R2的结合均显著增加。EMSA结果表明，EGF处理后C/EBPβ以LIP/LIP同源二聚体形式结合于203R1和203R2。过表达C/EBPβ LIP能显著降低野生型203CNS-Luc的荧光素酶活性，但对突变型m203CNS-Luc无作用。9. C/EBPβ LAP2与miR-146b mimic均能显著提高食管癌细胞EdU染色阳性率，降低细胞凋亡率。10.过表达C/EBPβ LAP2能以剂量依赖的方式增加miR-146b的表达水平；过表达C/EBPβ LAP1和C/EBPβ LIP对miR-146b的表达无影响。11.生物信息学分析发现，miR-146b转录起始位点上游5KB范围内的调控区域内有两个C/EBPβ结合位点，-1736/-1722（146R1）和-1492/-1478（146R2）区域。ChIP方法检测发现，与阴性对照组（IgG组）比较，C/EBPβ与146R1和146R2结合均显著高于对照组，其余两个阴性区域对照Neg.ctrl1和Neg.ctrl2均无C/EBPβ富集情况。与阴性对照空载体pcDNA3.1质粒比较，过表达C/EBPβ LAP2能显著提高野生型146CNS-Luc的荧光素酶活性降低，但对突变型m146CNS-Luc无作用。结论：1. C/EBPβ LIP在食管鳞癌组织中高表达并与淋巴结转移相关。2. C/EBPβ LIP通过转录抑制miR-203表达发挥促进食管癌细胞EMT、迁移和侵袭的功能。3. C/EBPβ LAP2通过转录激活miR-146b表达发挥促进食管癌细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能。综上所述，我们发现转录因子C/EBPβ在食管鳞癌组织中异常表达，该转录因子具有重要功能和意义，参与了食管癌细胞EMT、侵袭、迁移、增殖和凋亡等生物学行为。C/EBPβ的不同异构体通过不同的转录水平调节机制，负调控与EMT、转移相关的miR-203，正调控与增殖、凋亡相关的miR-146b，从而参与食管癌的发生与转移过程。本研究揭示了同一个转录因子调控不同miRNA分子的生物学意义，拓展了我们对基因表达调控机制的认识，有助于深入理解食管鳞癌发生发展的机制并为食管鳞癌的诊治提供依据，C/EBPβ有望成为治疗食管癌的新靶点。