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丝状病毒包含埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV),可在人类和灵长类动物中引起严重的出血热,致死率高达90%,目前尚无特异、有效的治疗方法和疫苗。埃博拉病毒最早报道于1976年在非洲中部暴发,目前共包括扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、莱斯顿埃博拉病毒和象牙海岸埃博拉病毒四个种。马尔堡病毒最早在1967年分离得到,目前只含有维多利亚湖马尔堡病毒一个种。伴随全球经济和旅游的持续快速发展,病毒性疾病的流行及传播已经没有了国界,另外、埃博拉病毒和马尔堡病毒作为生物安全四级病原因子,对人类健康和公共卫生安全造成严重威胁,且有可能被恐怖主义作为生物武器使用。因此,对其快速、灵敏和特异的检测研究具有重要的意义。
实时定量PCR技术以其迅速、简便、灵敏等优点广泛应用于病原微生物检测和诊断的各个领域,使分子生物学诊断技术发生了革命性变化。本研究采用实时定量PCR技术对丝状病毒的检测进行了研究。首先收集了GenBank中已有的16条埃博拉病毒和24条马尔堡病毒全基因组序列,比对、分析了全基因组及所含7个基因的序列。选取核蛋白基因作为研究对象,找出了核蛋白基因的保守序列用作实时定量PCR检测的目标序列,设计完成针对埃博拉病毒和马尔堡病毒核蛋白基因特异性检测的引物和探针。
通过实验验证,两组引物和探针均具有较好的特异性,交叉实验显示彼此间无交叉反应,根据标准曲线得到两组引物和探针PCR反应的Ct值和起始模板浓度关系方程,灵敏度实验显示埃博拉病毒引物和探针组及马尔堡病毒引物和探针组具有较高的灵敏度。本研究为进一步在生物安全四级实验室和暴发地进行实际样本的检测奠定了工作基础。