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犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）感染引起的急性、高度接触性传染病，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疾病之一。虽然常规弱毒疫苗在控制CD的发生中起到非常重要的作用，但也存在难以克服的缺点。弱毒苗可引起免疫抑制和中枢神经系统的损坏；随着CDV宿主谱日趋扩大，弱毒疫苗的使用还可能致死某些易感动物并带来散毒的危险。此外，CDV本身的变异也可能导致疫病的流行。为了研制新一代安全、高效的CDV基因工程疫苗，本实验在对CDV致病性和免疫原性密切相关的F和H两个囊膜糖蛋白基因分子生物学特性初步探讨的基础上，以犬瘟热病毒中国分离株为素材，分别构建了表达这二个糖蛋白基因重组真核质粒pcDNA-F和pcDNA-H，并在小鼠和犬体内测定了它们的保护性免疫效力。现从四个方面概述如下： 一、犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白F和H基因的克隆与表达 将犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒以提取RNA作为模板，用RT-PCR扩增出融合蛋白（F）基因的两片个片段（覆盖其融合区、穿膜区和部分附膜区，长度分别为769bp和832bp）及附着蛋白（H）基因的5’端和3’端的两片段（长度分别为945bp、904bp）。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进原核表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）下游，重组质粒转化宿主菌BL21后，在37℃1.0mMIPTG扬州大学博士学位论文诱导下，F基因、H基因分段获得了良好表达，表达产物经聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白大小分别为54Kda、56Kda和59Kda、58Kda。将表达产物回收后分别混合免疫小鼠，间接免疫荧光试验显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，两种基因产物混合免疫小鼠后能激发出1:16的中和抗体。实验结果表明体外表达的犬瘟热病毒囊膜糖蛋白基因保留了天然蛋白部分抗原性，有望以此为基础研制亚单位疫苗，其抗体则可用于犬瘟热病毒相关研究的诊断。二、犬瘟热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因的序列分析 以抽提的犬瘟热病毒中国分离株（CDv一YZ01OI，CDV一YZO102）基因组RNA为模板，采用RT一PCR分别扩增出病毒1989bp的融合蛋白（F）基因和1824bp的附着蛋白（H）基因，按常规方法克隆进pGEM一Teasy载体，经蓝白斑筛选和酶切分析获取阳性重组质粒，进一步测定并分析了F和H基因的序列。对于H基因而言，两种分离株核昔酸和编码氨基酸的同源性达98%左右，与国内长春分离株也有约%%的同源性，但与美国、日本分离株相比只有93一95%的同源性，然而，与两疫苗株（Ondersteroop株，Convae株）则只有90一910，0的同源性。氨基酸分析显示，中国分离株与其它分离株的H蛋白有8一9个潜在的天冬酞胺糖基化位点。相比之下，OP一CDV疫苗株则只有4个这类位点。从系统发生上，CDv一YZo101、CDv一YZoloZ株与长春分离株同属一个系，不同于美国、日本分离毒株，且野毒株与疫苗株相比，均存在着明显的差异。对F基因而言，中国分离株间核昔酸和编码氨基酸同源性高达99%，与德国分离株、海貂瘟热病毒11型（PDV一2）和疫苗株的核昔酸及编码氨基酸的差异主要在于一个较长的信号肤区域，而编码的成熟蛋白（FO）表现出较高的同源性，所有的13个半肤氨酸残基、4个潜在的天冬酞胺糖基化位点和推测与融合功能密切相关的两疏水区域均完全一致。该结果不仅证实了CDVF蛋白基因与H蛋白基因相比具有更高的同源性，且说明中国分离株的有些基因已显示出与国外参考株不同的差异。本实验丰富了犬瘟热病毒分子流行病学的资料，并为构建具有自主知识产权的基因工程疫苗提供了条件。徐向明:犬疽热病毒中国分离株遨膜精蛋白垂因序列分析及其DNA疫苗的免疫效力三、犬瘟热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因免疫小鼠诱发的抗体应答 经一系列步骤将CDV一YZO 101株的两囊膜糖蛋白基因定向导入真核表达载体pcDNA3 .l（一）中，DNA测序和酶切分析筛选阳性重组质粒克隆pcDNA一H和pcDNA一F，以重组质粒DNA和脂质体共转染COS一7细胞，用间接免疫荧光试验证实转染的COS一7细胞的胞浆中分别表达了CDv的H和F蛋白。 以聚乙烯胺（PEI）为佐剂，将犬瘟热病毒F和H基因重组质粒pcDNA一H和pcDNA一F的DNA分别或混合肌注6周龄BABL/c小鼠，同时设pcDNA原载体DNA对照。以2周为间隔共免疫4次，最后一次免疫后3周采血分离血清，酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验 （SN）分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果显示:pcDNA一H和pcDNA一F试验组免疫4次后分别激发T一02月3士o’64和1 02，9士0‘’34滴度的ELIsA抗体，两种质粒DNA混合免疫后产生了1:32一1:128的CDV中和抗体，而原载体DNA免疫后，用ELISA和SN未检测出特异的CDV抗体。表明犬瘟热病毒囊膜糖蛋白基因的DNA免疫能诱发小鼠体内产生特异性的体液免疫，这为进一步在CDV自然宿主犬体内的动物试验打下了基础。四、犬瘟热病毒囊膜糖蛋白基因和核蛋白基因免疫犬诱导的保护性免疫反应 由于CDV核衣壳蛋白（N）在病毒感染早期可引起强烈的抗体反应，且其上含有T淋巴细胞表位，在细胞免疫?