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研究背景在ICH S2（R1）遗传毒性试验标准组合中,体内啮齿动物造血细胞微核试验必不可少,但不适用于一些需要代谢活化的物质。因此,若需要两项体内试验结合体外试验来评估化合物的遗传毒性时,第二项体内试验建议选择对药物有充分暴露的组织进行（通常是肝脏）,如肝DNA链断裂试验。目前第二项体内试验常选择肝彗星试验,检测的是未被固定的DNA损伤。2017年国际遗传毒性试验（International Workshop on Genotoxicity Testing,IWGT）工作组指出,肝微核（Liver Micronucleus,LMN）试验可作为第二项体内试验,在以下两种情况下,①当体外遗传毒性试验提示有非整倍体代谢产物,且外周血/骨髓微核试验为阴性时,②当体外MN试验结果模棱两可或体内相关性结果可疑时,此时,外周血/骨髓微核试验联合LMN试验是合适的。LMN试验可检测遗传毒性肝致癌物,包括需要代谢活化形成遗传毒性中间产物的化合物,例如N-亚硝基二乙胺（N-Nitrosodiethylamine,DEN）,这些物质在常规啮齿类动物造血细胞微核试验中无法检出。目前,国际肝微核联合验证试验及本实验室前期开展的肝微核试验均采用胶原酶消化法,即使用胶原酶溶液消化新鲜肝组织制备细胞悬液,再进行肝微核评估的方法。然而,现有肝微核检测方法存在无法回顾性评估、检测效率低等缺点。目的本研究在传统的胶原酶消化法基础上,拟建立和验证福尔马林固定法LMN试验方法,实现样本长期保存后的回顾性评估,允许需要时随时检测（显微镜检）。福尔马林固定法的特点是,使用强碱性KOH溶液处理福尔马林固定肝组织来制备肝细胞悬液。此外,在显微镜检LMN试验方法发展成熟的基础上,拟建立和验证高通量的流式细胞术检测LMN试验方法,以便快速、客观地完成大量样本的检测。方法本课题分为四个部分:福尔马林固定法LMN试验方法的建立:首先使用肝微核阳性化合物DEN(12.5 mg.kg-1·day-1)开展14天重复给药肝微核试验,将福尔马林固定后的肝组织小块碱处理后,制得肝细胞悬液并染色阅片,获得福尔马林固定法LMN结果,与新鲜肝组织的胶原酶消化法LMN结果进行比较,建立福尔马林固定法LMN试验方法。福尔马林固定法LMN试验方法的验证:使用遗传毒性肝致癌物喹啉和NPYR（N-nitrosopyrrolidine,NPYR）、遗传毒性非肝致癌物甲磺酸甲酯（Methyl Methanesulfonate,MMS）对福尔马林固定法LMN试验方法进行验证,最后使用已建立的方法对未知遗传毒性化合物氢醌（Hydroquinone,HQ）进行检测。开展喹啉(30、60、120 mg.kg-1·day-1)、NPYR(25、50、100 mg·kg-1.day-1)、甲磺酸甲酯(12.5、25、50 mg·kg-1·day-1)和 HQ(75、150、300 mg·kg-1·day-1)重复给药肝微核试验时,同时获得体重、脏器重量及脏体比数据,并伴随其他遗传毒性指标,如肝彗星、外周血微核、磷脂酰肌醇聚糖A类基因（Phosphatidylinositol Glycan Complementation Group A Gene,Pig-a）突变试验。流式细胞术LMN试验方法的建立:采用DEN开展重复给药肝微核试验,使用过滤除菌的胶原酶溶液消化肝块得到肝细胞,保存于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的缓冲液中待检测,上机前处理使用1%IGEPAL溶液作为裂解液,Sytox Green作为核酸染液,Ki-67抗体标记肝细胞增殖,Rnase A除去RNA干扰,之后室温孵育待上机检测。将流式细胞术检测结果与胶原酶消化法LMN结果及文献结果进行比较,从而建立流式细胞术LMN试验方法。流式细胞术LMN试验方法的验证:仍采用遗传毒性肝致癌物喹啉和NPYR、遗传毒性非肝致癌物MMS,将流式细胞术检测结果与胶原酶消化法和福尔马林固定法LMN结果进行互相比较,对流式细胞术LMN试验方法进行初步验证,并运用已建立的方法对未知遗传毒性化合物HQ进行检测。结果1.福尔马林固定法和流式细胞术LMN试验方法的建立:DEN和溶媒对照组的福尔马林固定法肝微核率（micronucleated hepatocytes,MN-HEP%）和流式细胞术MN-HEP%,均与同时开展的胶原酶消化法MN-HEP%及文献结果基本一致。因此,初步建立了福尔马林固定法和流式细胞术大鼠肝微核试验方法。2.福尔马林固定法和流式细胞术LMN试验方法的验证:NPYR和喹啉LMN结果为阳性,MMS和HQ的LMN结果为阴性。福尔马林固定法与胶原酶消化法、流式细胞术与胶原酶消化法和流式细胞术与福尔马林固定法的相关性系数r分别为0.7041、0.8243和0.9379,提示三种方法所获得的MN-HEP%的相关性良好。因此,初步验证了福尔马林固定法和流式细胞术大鼠肝微核试验方法。3.开展重复给药肝微核试验过程中,伴随了多终点遗传毒性试验,如肝彗星试验、外周血MN试验以及Pig-a基因突变试验,以全面评价受试物的遗传毒性。比如遗传毒性非肝致癌物MMS:外周血微核结果、肝彗星试验及Pig-a基因突变试验结果均为阳性,肝微核试验为阴性。遗传毒性肝致癌物NPYR:外周血MN试验及Pig-a基因突变试验为阴性,肝彗星试验和肝微核试验为阳性。遗传毒性肝致癌物喹啉:肝彗星试验与外周血MN试验为阴性,而肝微核为阳性,提示了肝微核试验的必要性。未知遗传毒性化合物HQ:肝微核试验、肝彗星试验、外周血微核试验及Pig-a基因突变试验结果均为阴性,可初步判定HQ为非遗传毒性化合物。结论本文采用DEN作为模式化合物进行福尔马林固定法和流式细胞术LMN试验方法的建立,并选取2个已知的遗传毒性肝致癌物（NPYR和喹啉）、1个遗传毒性非肝致癌物MMS,分别对福尔马林固定法和流式细胞术LMN试验方法进行验证,最后应用已建立方法对未知遗传毒性化合物HQ进行检测。同时整合其他遗传毒性终点综合评估四个物质的遗传毒性。两种方法各具优势,福尔马林固定法LMN试验可对一般毒性试验中的福尔马林固定肝组织进行遗传毒性回顾性评估;流式细胞术LMN试验适用于新鲜肝组织的微核检测,相较于传统显微镜检法具有快速、高通量、客观性等优点。