高迁移率族蛋白1 (high mobility group box protein 1 ,HMGB1)是高迁移率族蛋白中的一种,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快而得名。HMGB1的基因同源性很高,人和鼠的同源性在99%以上。最初发现HMGB1是一种非组蛋白核蛋白,在核内能够识别和结合DNA,参与DNA的转录、复制、修复以及细胞运动等。后续的研究认为,HMGB1是一种具有双功能的警报素(alarmin),在细胞外具有细胞因子功能,可以启动天然和获得性免疫过程,并参与了败血症、感染和自身免疫等急慢性炎症过程。人HMGB1蛋白由215个氨基酸组成,包含两个结合DNA的功能结构域:A Box和B Box,以及一个富含酸性氨基酸的带负电的C末端。HMGB1的A Box和B Box可以非序列特异地结合于双螺旋DNA的小沟,可以使弯曲或扭结的DNA暂时线性化以利于其他酶或蛋白的结合,而C末端酸性氨基酸可以调节HMGB1同DNA的结合。近来利用体外间接ELISA检测HMGB1和DNA或其他分子的相互作用,发现HMGB1可以特异结合某些CpG ODN,并且可以结合IL-1β和LPS等。目前研究表明HMGB1的可能受体有3个:高度糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE),Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)和TLR4。RAGE属于免疫球蛋白超家族成员,表达于多种细胞表面,其配体有多个,其和HMGB1有较高的亲和力,HMGB1和RAGE结合后可以激活下游信号分子像MEK、MAPK和NF-κB等。1999年Wang等报道HMGB1是一种重要的晚期炎症介质参与了脓毒症的病理生理过程,介导了内毒素的致死效应,HMGB1在胞外作为一个细胞因子的作用逐渐被人们所重视。HMGB1可以激活单核/巨噬细胞,释放细胞因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6等,释放的细胞因子又可进一步激活单核/巨噬细胞,形成正反馈反应。HMGB1其胞外功能依赖B Box结构域,而单独的A Box肽段则可以抑制HMGB1或B Box肽段的作用。后续的研究表明HMGB1不仅参与了像脓毒症、急性肺损伤等急性炎症过程,而且参与了像类风湿性关节炎(rheumtoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)等自身免疫性炎症过程。在炎症反应中,HMGB1可以促进中性粒细胞黏附于血管内皮,进而渗出到炎症部位发挥抗炎作用,并且发现这种作用依赖于RAGE和β2整合素Mac-1。但是近来一些研究却得出不同的结论:HMGB1本身没有或只有很弱的细胞因子特性,体外并不能直接激活免疫细胞,而只是作为辅助因子参与各种免疫反应过程,以往实验认为其具有致炎细胞因子特性可能是因为研究所用HMGB1蛋白内含有内毒素、ODN CpG、细胞因子(IL-1β)或者其他细菌组分引起。如Jane Tian等发现大肠杆菌来源的重组HMGB1可以刺激靶细胞分泌致炎细胞因子,而从小牛胸腺中提取的HMGB1蛋白几乎不刺激产生致炎细胞因子,并且HMGB1中加入benzonase(一种RNA/DNA核酸内切酶)后其刺激巨噬细胞产生致炎细胞因子分泌的能力大大减弱,从而推测HMGB1具有的炎性刺激作用可能跟其在纯化过程中结合的细菌的RNA/DNA有关,后续的研究证实HMGB1作为辅助因子参与CpG DNA结合TLR9引发的免疫反应。外源性的HMGB1可以增强CpG ODN作用TLR9后细胞因子的分泌,并且这一作用依赖于RAGE,荧光共聚焦显示HMGB1-RAGE相互作用促进CpG ODN进入早期内体同TLR9结合从而激活MyD88通路。Ivanov S等得到相似的结果,hmgb1-/-的巨噬/树突状细胞在接受CpG DNA刺激后,TLR9从内质网-高尔基体中间体进入早期内体的高峰出现在加入CpG DNA后30分钟,而野生型巨噬细胞其高峰出现在5~15分钟,尽管两者内吞B类CpG DNA的速度相同,提示HMGB1促进TLR9进入早期内体同CpG DNA结合,增强CpG DNA刺激靶细胞细胞因子分泌水平。最近Sha Y等发现利用真核细胞表达系统重组获得的HMGB1几乎没有免疫活性,但表达系统中加入IL-1β后纯化的HMGB1有较强的激活巨噬细胞分泌TNF-α和MIP-2功能,后续的研究发现HMGB1结合IL-1β形成复合物可以有效激活巨噬细胞。Apetoh L等在肿瘤放化疗后产生的抗肿瘤免疫反应时发现,死亡的肿瘤细胞被抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)吞噬后,肿瘤抗原被加工递呈从而引起特异的抗肿瘤免疫反应依赖于肿瘤细胞来源HMGB1和APC来源的TLR4。进一步研究发现,HMGB1和位于APC细胞表面的TLR4结合抑制吞噬体和溶酶体结合,避免肿瘤抗原降解,使得肿瘤抗原被有效递呈。关于HMGB1的胞外活性不同时期、实验室得出不同的结论,由于大多数实验中使用的HMGB1大部分为原核表达系统表达的重组蛋白,在蛋白分离、纯化过程中可能残留各种原核细菌的组分,造成HMGB1胞外活性的不同,而其中最容易含有的就是内毒素。尽管大多数实验中使用的HMGB1重组蛋白经过除内毒素处理,但内毒素检测一般还残留约4EU/μg左右;如此低浓度的内毒素一般不能激活巨噬细胞产生大量细胞因子,因而被认为主要是HMGB1蛋白的直接作用。大量文献报道表明HMGB1激活巨噬细胞等免疫活性细胞是HMGB1参与像内毒素血症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病炎症反应的主要方式。上世纪90年代初,就有研究发现在约40%青少年RA患者血清中可以检测出抗HMGB1或2的抗体,到2002年研究发现在RA患者的血清和关节液内有异常增高的HMGB1,并在实验性RA大鼠模型中得到证实。2003年Pullerits R等在小鼠关节内注入重组HMGB1蛋白成功诱发小鼠关节炎模型,而对IL-1基因敲除的小鼠没有作用,研究发现HMGB1通过激活靶细胞NF-κB促使其分泌大量的IL-1β在小鼠关节炎的发病中起重要作用。后续的研究发现系统性给予可溶性RAGE可以显著降低HMGB1诱发的关节炎,从而证实了HMGB1可能通过RAGE激活靶细胞诱发实验性关节炎。给予HMGB1中和抗体或可以抑制HMGB1功能的A Box肽都可以显著降低病损部位的IL-1β表达和关节软骨损伤,减轻胶原诱导的实验性关节炎,证实HMGB1可能成为RA治疗新的靶位。一些研究表明有些抗风湿药就可能是通过抑制HMGB1的释放发挥治疗作用的,如硫代苹果酸金钠。金制剂属于慢作用抗风湿药物,研究发现硫代苹果酸金钠剂量依赖地抑制LPS刺激巨噬细胞引起的HMGB1分泌,可能是金制剂治疗RA的一个分子基础。为了进一步阐明HMGB1在RA疾病发生中的作用及其作用的主要细胞信号通路,以及阻断HMGB1或下游关键分子治疗RA的可行性,我们首先设计体外实验研究HMGB1激活巨噬细胞的分子机制,却意外发现不同批次的重组HMGB1激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的能力差异巨大,为了探讨HMGB1胞外活性差异的本质以及HMGB1激活巨噬细胞的分子机制,本研究通过体外和体内实验探讨HMGB1激活巨噬细胞的实质和通路来阐明HMGB1参与炎症免疫反应的方式,加深我们对于HMGB1本质的认识和为疾病的治疗提供理论支持。本研究分为三个部分:第一部分:考虑到HMGB1胞外活性差异较大,并且由于大多数实验中使用的HMGB1是原核表达系统表达的重组蛋白,在蛋白分离、纯化过程中可能残留各种原核细菌的组分,造成HMGB1胞外活性的不同,而其中最不容易清除的就是内毒素。我们利用小鼠腹腔巨噬细胞作为工具细胞,检测不同来源HMGB1激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的活性,结果发现不同批次HMGB1蛋白激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的活性差异很大,并且同其含有的内毒素含量正相关。不含内毒素的HMGB1体外几乎没有致炎活性,单独不能激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子;而内毒素含量超过3000EU/mg( Lot 077K4002)的HMGB1蛋白则可以激活巨噬细胞分泌大量的TNF-α,Real-time RT-PCR检测也显示致炎细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等mRNA表达显著上调。提示HMGB1本身胞外致炎活性很弱,激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的能力依赖于其结合的内毒素。第二部分:尽管第一部分的实验结果显示Lot 077K4002的HMGB1蛋白内毒素含量超过3000EU/mg(小于6000EU/mg),但不能完全解释巨噬细胞分泌的大量TNF-α,因为1μg/ml Lot 077K4002的HMGB1含有的内毒素水平在3-6EU/μg左右,这么低浓度的内毒素不能充分激活巨噬细胞分泌大量致炎细胞因子。因此我们推断HMGB1可以增强内毒素的活性,HMGB1和内毒素可以协同刺激巨噬细胞分泌致炎细胞因子。为了证实我们的假设,体外利用小鼠巨噬细胞模型,加入0.1μg/ml HMGB1和或0.1ng/ml LPS后培养一段时间,检测上清中细胞因子(IL-6和TNF-α)浓度和细胞内细胞因子mRNA(IL-1、IL-6、TNF-α和Cxcl2)表达水平,研究结果发现HMGB1和LPS之间确实存在协同作用;体内采用小鼠膝关节腔内注射5μg/ml HMGB1和或2ng/ml LPS诱发小鼠实验性关节炎模型,结果发现实验后7天,注射HMGB1+LPS组关节滑膜炎发生率和严重程度显著高于HMGB1或LPS单独作用组,体内证实在介导小鼠实验性关节炎的过程中HMGB1和LPS之间存在协同作用。第三部分:为了阐明HMGB1和LPS协同作用的分子机制,首先我们利用受体阻断性抗体(Anti-TLR2和Anti-TLR4)和竞争性融合蛋白(RAGE-Fc)阻断HMGB1目前已知的3个受体来研究HMGB1作用的可能途径,结果发现阻断TLR2受体不影响LPS和或HMGB1激活巨噬细胞,而阻断LPS受体TLR4后,巨噬细胞不被激活,上清中检测不出IL-6和TNF-α,Real-time RT-PCR检测也显示mRNA水平没有显著增高。采用竞争性融合蛋白(RAGE-Fc)阻断RAGE后,HMGB1和LPS协调刺激巨噬细胞的效应减弱了,表现为上清中IL-6和TNF-α浓度较未阻断组明显下降,Real-time RT-PCR检测也显示mRNA水平较未阻断组明显下调。因为LPS通过TLR4激活巨噬细胞,TLR4可能同时接受HMGB1和LPS作用,因此HMGB1可能通过TLR4或RAGE参与与LPS的协同作用。LPS和IL-1β作用不同受体(TLR4和IL-1R)却有相同的胞内信号途径,并且文献已报道HMGB1与IL-1β可协同刺激单核/巨噬细胞,我们进一步研究了HMGB1促进IL-1β介导的巨噬细胞活化分泌细胞因子的作用受体。阻断RAGE、TLR2和TLR4后,观察HMGB1与IL-1β协同刺激巨噬细胞分泌致炎细胞因子作用的变化,结果表明阻断TLR2和TLR4不影响LPS与IL-1β的协同作用;而阻断RAGE后,LPS与IL-1β协同刺激巨噬细胞的作用消失了,从侧面证明了HMGB1是通过RAGE促进LPS和IL-1β的致炎活性的。为了更好地证明HMGB1促进LPS介导的巨噬细胞活化和分泌致炎细胞因子是RAGE依赖的,我们利用TLR2和TLR4基因敲除小鼠进行进一步的实验,结果表明TLR2缺失不影响HMGB1与LPS或IL-1β之间协同刺激巨噬细胞分泌致炎细胞因子的作用;TLR4缺失不影响HMGB1与IL-1β之间协同刺激巨噬细胞分泌致炎细胞因子的作用。证实了HMGB1增强LPS和IL-1β的致炎活性是RAGE依赖的。其次,为阐明HMGB1和LPS协同作用的胞内信号通路,我们使用特异性抑制剂阻断RAGE下游信号中关键信号分子,检测信号分子阻断后HMGB1和LPS协同刺激巨噬细胞分泌致炎细胞因子能力的改变。结果表明采用SB203580特异抑制MAPK p38的磷酸化后,HMGB1与LPS之间的协同作用消失了;而采用Bay11-7085特异抑制NF-κB的活化后,HMGB1与LPS则不能激活巨噬细胞。证明HMGB1促进LPS介导的巨噬细胞激活依赖于RAGE下游的MAPK p38和NF-κB。进一步采用Western blot实验也证实HMGB1和LPS联合作用巨噬细胞15min组MAPK p38磷酸化水平和NF-κB活化水平显著高于HMGB1或LPS单独作用组,并且用RAGE-Fc融合蛋白预处理可以下调HMGB1和LPS联合作用组MAPK p38和NF-κB蛋白磷酸化水平。许多研究报道TLRs和RAGE下游信号分子存在广泛的crosstalk,可以放大或汇聚生物信号,并且这种crosstalk要求TLRs和RAGE的活化或者抑制信号在时间和空间上具有一定的同步性。有实验已经证实HMGB1可以结合LPS并有较强的亲和力,HMGB1/LPS复合物与小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4和RAGE结合后,引起下游MAPK p38蛋白发生磷酸化,TLRs和RAGE下游信号分子之间的crosstalk使MAPK p38磷酸化水平显著增高,引起巨噬细胞分泌致炎细胞因子的显著增强。这些结果表明重组HMGB1并不直接激活免疫活性细胞,而是通过增强LPS的致炎活性起作用;HMGB1是通过结合RAGE增强下游MAPK p38的磷酸化和NF-κB的活化而发挥作用。通过研究HMGB1的胞外作用,探讨其在诸如脓毒症、类风湿性关节炎中的作用和途径,有利于加深我们对HMGB1的认识和指导相关疾病的治疗。