论文部分内容阅读
背景:糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)是目前临床应用较多的一类药物,广泛用于炎症及免疫相关疾病的治疗,但是临床上有相当一部分病人的激素疗效并不理想。由于GC的药理作用主要是通过糖皮质激素受体(glococorticoid receptors,GR)介导发挥的,因此有研究认为GR的表达及其结和力是GC疗效的决定因素之一。如果GR表达或结合力处于一种较低的状态,即使体内GC水平很高,实际能与GR结合形成配体受体复合物的GC数量却有限,故激素的生物效应仍然较低。我课题组研究发现,出现激素抵抗的系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞GR的表达及结合力就明显低于激素敏感的病人。对于这部分病人,通常采用补充大剂量糖皮质激素,或者给予免疫抑制剂联合治疗的方法提高其疗效。然而,大剂量GC和免疫抑制剂的使用可以引起各种副作用的发生。而且长期大剂量应用激素又会进一步导致GR表达减少和结合力降低,从而加大后续治疗的难度。因此,寻找一种有效调节GR的药物一直是近年来研究的热点。近年来,中药在临床治疗中的地位越来越受到重视,我科室在前期研究中发现人参中主要有效成分人参总皂苷(ginsenosides,GSS)在体内外具有上调GR,并增强激素效应的作用。随后的临床研究也证实,GSS可以增强系统性红斑狼疮的糖皮质激素疗效,在不影响疗效的前提下有助于GC的减量。但是总皂苷成份复杂,包含了Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Ro、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、F1、F2等40余种单体皂苷,不利于临床推广和机制研究。因此,本研究将从总皂苷中筛选出一种或几种具有上调GR作用的单体,观察其在体内外对糖皮质激素抵抗的改善作用,并做初步机制探讨。本科题研究目的:1、从成分复杂的GSS中筛选能够上调GR表达和结合力的一种或几种单体,并筛选出上调效果最强的单体;2、以地塞米松(dexamethasone,Dex)作为阳性对照,观察该单体在体内外对糖皮质激素抵抗的炎症模型的作用,并对其机制做初步探讨。本课题采用的方法:1.采用Western-Blot、定量RT-PCR法筛选具有上调GR表达的单体,并运用放射性配基结合实验检测其对GR结合力的上调作用。2.体外观察Dex联合人参皂苷单体的抗炎作用,并初步探讨其分子机制。(1)我们先用Dex(1uM)联合人参皂苷单体(10uM)及单用Dex(1uM)预处理细胞2h(短期作用组,非激素抵抗模型)或者24h (长期作用组,激素抵模型),再用TNF-α干预8h,然后运用定量RT-PCR技术检测炎症因子IL-6、IL-17、MMP-1、TNF-α mRNA的表达,对比Dex联合人参皂苷单体与单用Dex在不同条件下的抗炎效果。(2)为了探讨Dex联合人参皂苷单体优于单用Dex的抗炎机制是否与NF-κB通路有关,我们设立短期作用组(2h)及长期作用组(24h),TNF-α干预,相同条件下,采用Western-Blot技术观察其抗炎作用是否通过影响P65通路发挥。(3)因为人参皂苷单体能够抑制GR蛋白表达及结合力的下调,我们运用双荧光素酶报告基因法观察其是否增强GRE的转录激活。同时用Dex联合人参皂苷单体及单用Dex处理肝原代细胞,观察GR的数量及结合力的提高是否会激活与高血糖相关的酶,因此我们运用定量RT-PCR法检测糖异生相关基因G-6-P、PEPCK,观察其是否处于高表达状态。3.DBA-1关节炎症模型小鼠验证所选单体的体内抗炎效果。牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂混合物诱导关节炎模型,将模型小鼠随机分组分成生理盐水(Nerative)组、Dex(1.5mg/kg·d)组、Dex(1.5mg/kg·d)+Rh1(25mg/kg·d)组,连续给药14天。每天观察小鼠关节炎症反应情况,并给予评分,治疗结束后观察血糖,定量RT-PCR法检测GR、G-6-P、PEPCK的表达。结果表明:1.人参总皂苷中三个单体Rh1,Rb1,Rb3具有抑制GR表达和结合力下调的作用,其中Rh1作用最为明显;2.体外研究显示,人参皂苷Rh1与Dex联合应用对TNF-α诱导生成的炎症因子IL-6、IL-17、MMP-1、TNF-α mRNA表达具有明显的抑制作用(P<0.01),即使对Dex处理24h后的细胞(激素抵抗模型),该联合方案也具有明显的抑制作用,而单独使用Dex则抑制炎症作用减弱。进一步研究发现,无论是在激素抵抗还是非激素抵抗模型中,人参皂苷Rh1联合Dex均可以抑制P65核转位,抑制IkB磷酸化,而单独使用Dex对激素抵抗的P65通路则无抑制作用。以上作用与Rh1抑制GR表达和结合力下调密切相关。由于Rh1具有抑制GR的下调作用,双荧光素酶报告基因结果也显示与Dex组相比,Rh1联合Dex可以轻微增强GRE的转录激活,但有趣的是,对GRE激活的糖异生相关基因G-6-P、PEPCK,Rh1联合Dex却没有激活作用。体内研究采用DBA-1关节炎模型小鼠,研究证实,与单独给予Dex比较,Rh1联合Dex能够更有效地抑制小鼠关节炎症反应(P<0.01),且不会引起GR下调,同时也不会产生血糖升高的副作用。结论:人参皂苷单体Rh1通过抑制GR下调明显改善激素抵抗,同时抑制高血糖的发生,因此可以作为激素辅助用药增强疗效,减轻副作用,值得临床进一步验证。