大肠杆菌过氧化物酶EfeB的生理功能及其对血红素代谢的影响

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大肠杆菌过氧化物酶EfeB,属于染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase,DyP-type)的超家族,该家族的酶类一般具有良好的合成染料降解能力,但是EfeB在生物体内的功能尚不清楚;血红素(heme)是一种以亚铁为中心离子的卟啉化合物,作为包括EfeB在内的蛋白辅因子,具有重要的生物学功能,以及实际应用价值。本文以Escherichia coli BL21(DE3)为对象,以efeB基因为目标,通过转录组学和调控相关基因表达的方法,研究了EfeB在大肠杆菌中的生理功能以及其对大肠杆菌血红素合成的影响。主要研究内容与结果如下:(1)EfeB生理功能的解析。通过比较出发菌株BL21和efeB基因缺失菌Eco△efeB在不同条件下的细胞生长、对铁离子应答上以及基因组转录水平上的差异,结果表明在pH为7.0时,BL21和EcoΔefeB的生长无显著差异,但在pH为4.5时BL21的生长明显优于EcoΔefeB,efeB基因的表达可以支持大肠杆菌在低pH下的生存;当培养环境中有Fe2+存在时,efeB的表达显著上调。通过转录组测序、GO和KEGG分析,结果表明efeB基因的缺失会引起菌体1765个基因出现差异表达,而这些基因主要与菌体的细胞代谢途径、细胞膜合成和鞭毛的合成运动有关。(2)efeB基因表达对血红素合成的影响。通过对efeB基因的过表达和敲除,以及在过表达菌和敲除菌中过表达编码亚铁鳌合酶的基因hemH,构建了菌株EcoΔefeB/pEH和Eco/pEHE,检测了各个菌株的血红素含量,探讨了不同基因表达水平对大肠杆菌血红素合成的影响。结果表明efeB基因的缺失对大肠杆菌血红素的合成影响不明显,而efeB的过表达可以在一定程度上提高大肠杆菌的血红素产量;过表达hemH会对血红素合成产生抑制,而efeB和hemH的共表达则会显著提升胞内血红素含量,达到了4.68μmol·L-1,相对于出发菌株BL21提高了约1.72倍。(3)efeUOB操纵子调控对血红素合成的影响。通过对编码铁摄取调节子的基因fur的敲除,对efeUOB操纵子进行调控。在fur敲除菌中分别过表达了基因efeB和hemH,构建了菌株EcoΔfur/pEE和EcoΔfur/pEH,通过实时荧光PCR的方法进行了验证并检测了各个菌株的血红素含量。结果表明efeUOB操纵子调控的影响因素复杂,在本研究的培养条件下fur的缺失对其调控效果并不明显,efeUO基因的表达并未发生显著上下调;而重组菌的血红素含量检测结果表明,fur的缺失会抑制大肠杆菌血红素合成,使菌体的血红素含量大幅下降,过表达hemH会加剧这一影响,使血红素含量进一步下降,而在过表达efeB后血红素含量会有所回升,约为出发菌株BL21含量的2/3。
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