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精神分裂症(schizophrenia)是一种临床常见的严重的精神疾病之一,对该病的病因和发病机制的研究一直是精神病学研究的热点。目前认为精神分裂症是由多个微效或中效的基因共同起作用、并且易受环境因素影响的复杂多基因遗传疾病。近几年来,神经发育学说受到较多关注。该学说认为遗传因素也包括早期的环境因素影响了神经系统的正常发育,导致神经元增殖、分化、移行、胞突过度修剪,突触异常联系。幼年期尚不出现精神症状,仅为一些轻微躯体运动异常:青春期内分泌和其他生理功能剧烈变化,或者出现大的生活事件,神经系统发育缺陷的脆弱性在此时就显现出来,导致出现分裂症的临床症状。目前已有研究表明Netrins在轴突导向和细胞迁移中具有重要的作用,NTNG1基因同精神分裂症发病研究仅见日本人群,目前在汉族人群当中尚无相关报道。
目的：
应用病例对照研究的方法研究NTNG1基因的三个多态位点同精神分裂症的关联,并进行单倍型构建,将基因同临床特征相联系,以探讨NTNG1基因在北方汉族人群精神分裂症发病当中的地位和作用。
材料和方法：
1、样本
研究对象为无血缘关系的精神分裂症患者316例,男性169人,女性147人,年龄16-56岁,平均年龄(37.75±8.83)岁。其中首发病例252例,男性138人,女性114人,平均年龄(32.92±8.07)。病例来自中国医科大学附属第一医院精神医学科、沈阳市精神卫生中心、抚顺市煤矿脑科医院、本溪市心理卫生医院。均排除其他分裂谱系精神障碍、器质性精神障碍及其他精神疾病、神经系统疾病和严重躯体疾病。同实验组及组内无血缘关系的健康志愿者311人,男性161人,女性150人,年龄17-58岁,平均年龄(38.54±9.81)岁,组成对照组,对照组来自于沈阳市中心血站和中国医科大学附属第一医院体检中心。入组前需用DSM一Ⅳ健康人群版排除精神疾病,无严重躯体疾病,无药物滥用史。对照组性别(x2=0.184。P=0.668)、年龄(T=-0.926,P=0.355)与病例组完全匹配,两组人群均为汉族。所有入组者均签署知情同意书。
2、临床资料收集、诊断标准及临床资料评估
所有精神分裂症患者均严格按照美国精神障碍诊断与统计手册第四版(DSM-Ⅳ)进行,由两名主治医师及以上人员独立做出相同诊断。同时排除资料不全或难以判定的病例。记录患者年龄、性别、起病年龄、临床分型、病前性格特征,有无家族史,首发病例进行临床症状资料采集。
3、血样收集与处理
在签署知情同意后,抽取外周静脉血5毫升,置于EDTA抗凝管,采血后立即冷藏,用酚氯仿法进行DNA提取。
4、DNA含量及纯度的检测
使用紫外分光光度仪,分别取波长260nm、280nm两个波段,测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值,然后再通过公式计算纯度。
5、SNPs的选择
确定候选基因上含有RFLP的SNPs,通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP等人类基因组数据库,确定与疾病相关的染色体阳性区域内所有已知基因和表达序列标志(Expressed Sequence Tag,EST),只选择杂合度大于10％的sNPs位点进行大样本的基因型鉴定。
6、PCR引物的设计
确定待测SNPs后,利用SNPs数据库网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网络服务系统查询含有待测SNPs的DNA序列,应用premier3.0软件设计引物。
7、DNA扩增酶切及基因型判断
应用PCR反应进行DNA扩增。取适量的PCR扩增产物,与含有一定量相应限制性内切酶及其酶切缓冲液的体系充分混匀,置PCR仪中孵育3～5小时。琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱判断基因型。
8、建立数据库及统计学处理
所有结果录入Haploview和SPSS数据库,对单倍型、以及基因型及等位基因频率与临床特征进行相关分析。
实验结果：
1、临床调查表的统计分析
精神分裂症患者316例,男性169人,女性147人,平均年龄(37.75±8.83)岁。其中首发病例252例,男性138人,女性114人,平均年龄(32.92±8.07)岁。家族史、病前性格、临床分型在不同性别分布上没有显著性差异。
2、等位基因及基因型频率
(1)rs4132604
等位基因频率(x2=7.858,P=0.0051)和基因型分布(x2=7.667,P=0.022)在实验组和对照组间存在显著性差异,提示该基因在中国北方汉族人群中同精神分裂症的发病明显相关。
(2)rs2218404
患者组与对照组未见显著性差异。
(3)rs1373336
患者组与对照组未见显著性差异。
3、单倍型分析
在rs4132604-rs2218404中的GG(x2=6.107,P=0.0135 OR=1.325.95％CI=1.061-1.654)和TG(x2=5.275,P=0.0216,OR=0.756,95％CI=0.597-1.958),rs2218404-rs1373336中的GT(x2=5.379,P=0.0204 OR=1.303.95％CI=1.044-1.628)和GC(x2=4.716,P=0.0299,OR=0.756。95％CI=0.602-0.971),rs4132604-rs2218404-rs1373336中GGT(x2=13.405,P=0.0003,OR=1.519,95％CI=1.214-1.901)和TGT(x2=6.561,P=0.0104OR=0.574,95％CI=0.375-0.877)两组间存在显著性差异。
4、SNPs与精神分裂症临床特征相关性分析
(1)SNPs与病人性别相关性分析
结果表明三个多态位点等位基因频率在性别分布上无显著性差异。
(2)SNPs与病人病前性格相关性分析
rs4132604同病前性格有关联(x2=13.186,P=0.010),其它两位点无关联。
(3)SNPs与病人家族史的相关性分析
结果表明三个多态位点等位基因频率在有无家族史方面无显著性差异。
(4)SNPs与病人临床分型的相关性分析
结果表明三个多态位点等位基因频率在临床分型分布上无显著性差异。
(5)SNPs与临床症状相关性分析
rs4132604等位基因频率分布在有无关系妄想(x2=20.328,P=0.0000)、被洞悉感(x2=8.531,P=0.014)、被害妄想(x2=11.105,P=0.004)、嫉妒妄想(x2=8.334,P=0.015)症状方面存在差异,rs1373336的等位基因频率分布在有无关系妄想(x2=15.905,P=0.000)、被害妄想(x2=14.367,P=0.001)、嫉妒妄想(x2=11.716,P=0.003)症状方面存在差异。另一个位点没有差别。
结论：
1、NTNG1基因的rs4132604多态位位点同精神分裂症存在关联。
2、NTNG1基因的rs4132604、rs2218404、rs1373336构成的单倍型上存在同精神分裂症发病的相关位点。
3、NTNG1基因的rs4132604与精神分裂症患者病前人格、关系妄想、被洞悉感、被害妄想、嫉妒妄想症状相关联。
4、NTNG1基因的rs1373336与精神分裂症关系妄想、被害妄想、嫉妒妄想症状相关联。
本研究的创新性的自我评价
首次应用病例对照研究NTNG1基因同北方汉族人群精神分裂症的关系,同时进行了敏感位点的单倍型构建,并将基因多态位点同临床特征和临床症状进行关联分析,探讨该基因在精神分裂症发病当中的作用。