论文部分内容阅读
背景:脑血管疾病已成为全球第二大死亡病因。在我国,缺血性卒中占整个脑血管疾病的85%左右。按经典的缺血性卒中病因学分型—TOAST分型,最大比例的病因即为大动脉粥样硬化。已有广泛的研究阐述动脉粥样硬化的发病机制,在动脉粥样硬化发生、发展的众多因素中,血管平滑肌结构及功能的的改变在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用,血管平滑肌细胞主要参与了动脉粥样硬化病程的中期和晚期。在动脉粥样硬化的病程中,血管平滑肌细胞从中膜向内膜迁移,并在内膜下增殖和分泌细胞外基质,从而促进了动脉粥样硬化发生及发展。目前研究提示:血管平滑肌细胞的表型转化启动了细胞的异常增殖、迁移。血管平滑肌细胞分为收缩型和合成型,生理条件下表现为收缩型,迁移、增殖能力比较低,在各种病理因素(如机械刺激)刺激下,平滑肌细胞首先发生表型转化,由生理状态下的收缩型向具有很强迁移、增殖能力的合成型转变,合成型的血管平滑肌同时可分泌大量细胞外基质。血管平滑肌细胞的表型转化在动脉粥样硬化、血管成形后再狭窄、高血压的病理进程中起重要的作用。血管紧张素Ⅱ属于肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensinsystem,RAS)的效应分子,可以诱导血管平滑肌细胞从收缩型向合成型转变。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferator activated-receptor gamma,PPAR–γ)是一种依赖配体激活的转录因子[1]。激活PPAR–γ具有多种生物学效应,体外实验和动物试验都证明激活PPAR–γ具有血管保护作用,且可以拮抗血管紧张素Ⅱ的生物效应。目的探讨PPAR–γ对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠血管平滑肌细胞表型转化的作用及其可能的机制。方法研究采用体外小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)培养模型,为观察血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)和激活PPAR-γ对细胞功能及微丝骨架的影响,将细胞样本分为对照组、AngⅡ处理组、罗格列酮(PPAR-γ特异性激动剂)预处理+AngⅡ刺激组和(或)罗格列酮刺激组。应用Transwell法检测细胞迁移、MTT法检测细胞增殖、ELISA法检测培养细胞上清液Ⅰ型胶原水平,并用带荧光标记的鬼笔环肽结合VSMCs微丝的F-actin蛋白,在激光共聚焦扫描显微镜下观察微丝形态。在探究激活PPAR-γ对AngⅡ诱导VSMCs表型转化的作用和机制过程中,将培养细胞样本分为对照组、AngⅡ处理组、罗格列酮预处理+AngⅡ刺激组和(或)罗格列酮刺激组,应用RT-q PCR法和Western blot法分别检测PPAR-γ、PKGΙα以及VSMCs收缩型标志因子平滑肌22α蛋白(Smooth muscle 22 alpha,SM22α)m RNA和蛋白水平。同时,用ELISA法检测了罗格列酮对PKGΙα上游作用分子c GMP水平的影响。为明确罗格列酮是通过PPAR-γ途径来调控PKGΙα途径和细胞表型转化,引入了PPAR-γ抑制剂GW9662预处理,应用Western blot再次检测PKGΙα和SM22α蛋白水平。结果(1)培养的小鼠VSMCs在给予血管紧张素Ⅱ刺激后,VSMCs的增殖明显增强(0.68±0.03vs.0.72±0.02,P<0.05)同时伴有迁移能力明显增强(18.47±2.03vs.25.13±3.38,P<0.05),罗格列酮(20μmol/L)预处理可显著抑制血管紧张Ⅱ诱导VSMCs的迁移(25.13±3.38 vs.16.87±2.85,P<0.05)和增殖(0.72±0.02 vs.0.65±0.05,P<0.05)的增强。(2)给予血管紧张素Ⅱ刺激后,VSMCs形态不规则,有伪足伸出,微丝粗大并且数量增多,荧光强度增强。罗格列酮(20μmol/L)预处理后细胞呈长梭形,未见伪足,微丝溶解为点状,荧光强度减弱,提示罗格列酮可抑制血管紧张素Ⅱ诱导VSMCs的骨架重塑。(3)罗格列酮(20μmol/L)可显著降低VSMCs分泌Ⅰ型胶原水平(98.73±13.19vs.75.86±27.06,P<0.05)。(4)RT-q PCR结果显示:给予血管紧张素Ⅱ刺激后,VSMCs的SM22α和PKGΙα的转录水平降低,罗格列酮(20μmol/L)预处理后可抑制血管紧张素Ⅱ诱导PKGΙα(0.52±0.13 vs.1.46±0.23,P<0.05)和SM22α(0.65±0.10 vs.1.18±0.30,P<0.05)m RNA的下调作用。(5)Western blot结果显示:给予血管紧张素Ⅱ刺激后,VSMCs的PKGΙα蛋白水平显著降低(1±0 vs.0.76±0.10,P<0.05),同时伴有SM22α蛋白水平降低(1±0 vs.0.63±0.11,P<0.05),罗格列酮(20μmol/L)预处理后可抑制血管紧张素Ⅱ诱导PKGΙα蛋白下调(0.76±0.10 vs.1.31±0.12,P<0.05),同时可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导SM22α蛋白水平的下调(0.63±0.11 vs.1.13±0.07,P<0.05);PPAR-γ抑制剂GW9662可减弱罗格列酮对PKGΙα(P<0.05)和SM22α(P<0.05)的促表达作用。(6)罗格列酮对VSMCs胞内c GMP水平没有显著影响(33.15±3.43 vs.35.55±6.18,P>0.05)。结论研究结果提示:PPAR-γ激动剂可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌的表型转化,从而抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移、分泌细胞外基质和骨架重塑。PPAR-γ激动剂抑制血管平滑肌细胞表型转化的作用可能是通过PKGΙα途径来实现。PPAR-γ激动剂对PKGΙα途径的激活不依赖cGMP水平的提高。