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目的:双膦酸盐类药物在治疗骨质疏松和恶性肿瘤骨转移方面取得显著成果,但随着该类药物的广泛应用,双膦酸盐性颌骨坏死(Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws,BRONJ)作为不良反应之一,在国际上引起了广泛的注意,但其机制尚不明确。本研究观察SD大鼠在应用唑来膦酸后下颌骨的组织学改变,探究双膦酸盐性颌骨坏死发生前颌骨组织形态学的变化,为进一步研究双膦酸盐性颌骨坏死提供基本数据和研究基础,为临床预防和治疗提供理论指导。方法:选择健康3月龄的雌性SD大鼠36只,体重220±20g,自由摄食水,适应性喂养1周后随机分为3组,每组12只。A组(单纯应用唑来膦酸组):唑来膦酸经腹腔注射,浓度0.1mg/ml,剂量0.2mg/kg,每两天一次,持续8周。生理盐水按照每100g体重0.5m L灌胃,每日一次,持续8周。B组(唑来膦酸联合钙剂组):唑来膦酸经腹腔注射,浓度0.1mg/ml,剂量0.2mg/kg,每两天一次,持续8周。将浓度0.84%钙尔奇(碳酸钙+维生素D)混悬液按照每100g体重0.5m L灌胃,每日一次,持续8周。C组(对照组):按照SD大鼠体重2ml/kg腹腔注射无菌生理盐水,每两天一次,持续8周。生理盐水按照每100g体重0.5m L灌胃,每日一次,持续8周。8周后,三组动物均停药,每组12只大鼠再随机分为拔牙组(3只)和非拔牙组(9只),所有动物均存活,在处死前无异常表现及不良反应。拔牙组:在10%水合氯醛全麻下拔除SD大鼠左侧下颌第一臼齿,而后继续饲养4周处死取下颌骨。非拔牙组:在用药开始后的第8周、10周、12周时分别将每组SD大鼠随机处死3只,取大鼠下颌骨。所有标本置于10%甲醛溶液中固定48小时,经流水漂洗24小时,PBS缓冲液(0.01mol/L,PH=7.4)漂洗3min后,置于10%乙二胺四乙酸二钠溶液中脱钙,每两天更换一次脱钙液,期间每天充分震荡。脱钙1个半月后,流水漂洗24小时,10%甲醛溶液固定30mim,乙醇逐级脱水,浸蜡,常规石蜡包埋,沿矢状位制作厚度为4μm的组织切片,HE染色进行组织形态学观察,并使用计算机医学数码病理图像分析系统Med6.0进行骨组织形态计量学检测。使用免疫组化方法,对下颌骨血管的内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)进行检测,并用专业图像分析软件Image-pro plus6.0测量VEGF平均光密度值(Integrated optical density,IOD)。使用SPSS21.0统计软件进行处理,所有计量资料数据均以均数±标准差(x±s)的形式表示,每项指标的各组数据进行正态性及方差齐性检验,服从正态分布和方差齐性(Homogeneity of variance),各组数据采用析因设计方差分析,两两比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)检验,检验水准α=0.05,P<0.05具有统计学意义。结果:1 大体观察A、B、C组中非拔牙组的SD大鼠在8周、10周、12周时,下颌磨牙区牙龈无红肿及出血,无渗出物及瘘道,下颌骨无死骨暴露。A、B、C组中拔牙组SD大鼠在拔牙后4周时,拔牙创愈合情况出现差异,A组大鼠拔牙创愈合差,周围牙龈破溃,红肿;B组拔牙创愈合较差,牙龈色红,A、B组均未见死骨暴露;C组SD大鼠拔牙创愈合良好,软组织无红肿,无出血。2 组织学观察开始用药后8周:A组根尖周围可见炎性浸润,骨小梁排列紊乱,炎性细胞密集,主要为中性粒细胞,多核巨细胞,淋巴细胞,浆细胞等,其间分布的毛细血管,部分骨小梁破坏吸收,未见死骨形成,其范围主要局限在根尖周围,牙周膜和其它部位未见明显炎性浸润;非根尖区骨小梁粗大,连接成网状,骨髓间隙小,骨密质较厚。B组:根尖区域亦可见炎性浸润,但较A组范围小,骨小梁周围分布大量淋巴细胞,浆细胞,中性粒细胞等,部分骨小梁破坏吸收;非根尖区域骨小梁排列紧密且规律,连接成网状。C组:根尖区骨小梁排列规律,骨小梁较细,骨髓间隙大,骨小梁连接成网状,根尖下方无明显的炎性浸润,骨小梁无破坏吸收,没有形成明显炎性浸润区,牙周膜周围无炎性细胞分布。开始用药后10周:A和B组根尖周围仍可见大范围的炎性浸润,范围较8周时增大。炎性浸润区中性粒细胞,浆细胞和淋巴细胞更加密集,浸润区骨小梁排列紊乱,骨小梁破坏吸收明显,未见死骨形成,散在分布着毛细血管。但B组炎性浸润范围较A组局限。非根尖区内骨小梁粗大,骨髓间隙小,骨小梁排列规律,无破坏吸收,牙周膜周围无炎性细胞分布。C组:根尖区骨小梁排列规律,根尖下方可见散在炎性细胞分布,骨小梁无破坏吸收,周围区域和牙周膜未见炎性细胞浸润。开始用药后12周:A、B组中根尖区可见大范围炎性细胞浸润,骨小梁破坏溶解程度高于10周,骨小梁排列紊乱,未见死骨形成,炎性浸润范围A组大于B组。非根尖区骨小梁排列紧密,骨小梁粗大,连接成网状或片状,骨髓间隙小,牙周膜周围无炎性细胞分布。C组中骨小梁排列规则,连接成片,根尖周围区无明显炎性浸润区,骨小梁粗大,无破坏吸收,牙周膜周围无炎性细胞分布。开始用药后12周拔牙组:拔牙后A、B组根尖区炎性浸润范围较12周非拔牙组变大,拔牙创内未见新生的骨小梁,根尖区炎性细胞更加密集,范围更广,骨小梁破坏吸收更明显,但未见死骨形成。C组拔牙窝可见不成熟的骨小梁,排列疏松,骨小梁纤细,连接成网状。根尖区可见少许炎性细胞分布,骨小梁排列规律,无破坏吸收,与12周未拔牙的C组根尖区比较无明显差异。3 骨组织形态计量学检测3.1 下颌骨的骨密质开始用药后8周、10周、12周大鼠下颌骨骨密质厚度比较,组别和时间的相互作用经统计学处理无交互作用。下颌骨骨密质各组间比较结果:C组<A组<B组,统计学处理,三组之间有统计学差异(P<0.05)。用药后8周、10周、12周三个时间点骨密质厚度比较无显著性差异(P>0.05)。3.2 下颌骨根尖区的骨松质开始用药后8周、10周、12周下颌骨根尖区骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度和炎性浸润程度比较,组别和时间的相互作用经统计学处理无交互作用。不同组别间下颌骨根尖区骨松质的骨小梁面积和骨小梁周长结果比较:A组<B组<C组,统计学处理,各组间具有统计学差异(P<0.05);各组间骨小梁宽度比较结果:A组<B组<C组,统计学处理,A组和B组之间无统计学差异(P>0.05),A组和C组之间、B组和C组之间均有统计学差异(P<0.05);各组间炎症浸润程度比较结果:A组>B组>C组,统计学处理,A组和B组之间无统计学差异(P>0.05),A组和C组之间、B组和C组之间均有统计学差异(P<0.05)。用药后8周、10周、12周三个时间点下颌骨根尖区骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度和炎性浸润比较无显著性差异(P>0.05)。开始用药12周后,拔牙组与非拔牙组下颌骨根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度和炎性浸润比较,组别和是否拔牙的相互作用经统计学处理无交互作用。不同组别间下颌骨根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度比较结果:A组<B组<C组,统计学处理,A组和B组之间无统计学差异(P>0.05),A组和C组之间、B组和C组之间均有统计学差异(P<0.05)。各组间炎性浸润比较结果:C组<B组<A组,统计学处理,A组和B组之间无统计学差异(P>0.05),A组和C组之间、B组和C组之间均有统计学差异(P<0.05)。在拔牙组和非拔牙组间下颌骨根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度比较结果:非拔牙组高于拔牙组,统计学处理,两组间有统计学差异(P<0.05),炎性浸润的比较无显著性差异(P>0.05)。3.3 下颌骨非根尖区的骨松质开始用药后8周、10周、12周下颌骨非根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度比较,组别和时间的相互作用经统计学处理无交互作用。各组间下颌骨非根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长的比较结果:C组<A组<B组,统计学处理,各组间均具有统计学差异(P<0.05),骨小梁宽度的比较三组之间无统计学差异(P>0.05)。在8周、10周、12周三个时间点下颌骨非根尖区的骨松质骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁宽度的比较结果,骨小梁面积:S8<S10<S12,统计学处理,10周与12周之间无统计学差异(P>0.05),8周与10周、8周与12周之间均有统计学差异(P<0.05)。骨小梁周长:C8<C10<C12,统计学处理,8周与10周之间无统计学差异(P>0.05),8周与12周、10周与12周之间均有统计学差异(P<0.05)。骨小梁宽度:W8<W10<W12,统计学处理,8周与10周、10周与12周之间均无统计学差异(P>0.05),8周与12周之间有统计学差异(P<0.05)。4 下颌骨血管VEGF的平均光密度值开始用药后8周、10周、12周三组大鼠下颌骨血管VEGF平均光密度值的比较,对组别和时间的相互作用经统计学处理有交互作用。各组间下颌骨血管VEGF的平均光密度值比较:A组<B组<C组,统计学处理,各组间均具有统计学差异(P<0.05);在8周、10周、12周三个时间点下颌骨血管VEGF的平均光密度值比较:IOD(8周)<IOD(10周)<IOD(12周),统计学处理,各时间点间均具有统计学差异(P<0.05)。开始用药后12周时,拔牙组与非拔牙组下颌骨血管VEGF的平均光密度值比较结果:对组别和是否拔牙的相互作用经统计学处理有交互作用。拔牙组与非拔牙组间下颌骨血管中VEGF的平均光密度值比较:拔牙组VEGF的平均光密度值高于非拔牙组,统计学处理,两组之间具有统计学差异(P<0.05)。各组间下颌骨血管中VEGF的平均光密度值比较:A组<B组<C组,统计学处理,各组间均具有统计学差异(P<0.05)。结论:1 全身应用唑来膦酸对大鼠下颌骨的组织形态是有影响的,下颌骨的骨密质厚度增加,非根尖区骨松质的骨密度增加,而根尖区骨松质的骨小梁排列紊乱,骨小梁周围出现炎性细胞浸润。2 全身应用唑来膦酸后,大鼠下颌骨血管形成受到抑制,血液供应减少。3 大鼠全身应用唑来膦酸后,在下颌骨发生坏死之前颌骨的组织形态已经发生了变化,这可能是拔牙或颌骨手术后造成颌骨坏死发生的病理基础。