目前,我国江苏、重庆、福建、浙江、江西、山东等多省爆发鸭坦布苏病毒病,给我国养鸭业带来了严重经济损失。虽对该疫病的检测方法较多,但尚无商品化的检测试剂盒来方便快捷地检测DTMUV的感染。基于本实验室现有的CQW1株鸭坦布苏病毒(GenBank登录号:KM233707.1)的重组E蛋白,本研究制备出抗DTMUV单克隆抗体,并研制出检测试剂盒,为试剂盒的商业化发展奠定基础。1.DTMUV-E蛋白单克隆抗体的制备利用DTMUV-E蛋白作免疫抗原,通过杂交瘤技术,制备出两株杂交瘤细胞A6E7和D1D7。经辛酸-硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化,得到两株浓度分别为0.97mg/mL和1.09mg/mL的单克隆抗体A6E7和D1D7。亚类分析表明,两株单克隆抗体重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。间接IFA和WB试验分析显示,A6E7和D1D7均能特异性识别DTMUV,与GPV、DPV和DHAV-1均无交叉反应。通过分析单克隆抗体识别的抗原表位情况,结果表明A6E7和D1D7识别同一抗原表位。进一步分析单克隆抗体对E蛋白的相对亲和力,发现A6E7相对亲和力要大于D1D7,其能与E蛋白更好的反应。2.DTMUV-E蛋白抗体检测试剂盒的研究将单克隆抗体A6E7进行辣根过氧化物酶标记,制备出酶标单抗。进而包被E蛋白,建立了直接阻断ELISA方法。通过优化试验条件,结果表明E蛋白最适包被浓度为3.75μg/mL,血清和酶标单抗最佳稀释度分别为1:2和1:400,抗原最佳包被时间37℃2h,最佳封闭时间37℃1h,血清和酶标单抗最佳温育时间均为37℃1h,最佳显色时间10min。在此基础上,对试剂盒组分进行处理,制备并组装出试剂盒。特异性试验表明,对DHAV-1、DHAV-3、DPV、RA、DuCV阳性血清均无交叉反应发生。通过检测60份已知背景的鸭血清样品,该试剂盒检测准确率100%,其敏感性良好。重复性试验和稳定性试验分析表明,该试剂盒重复性好,能在4℃条件下稳定保存7个月。检测324份临床鸭血清样品,并与已报道的间接ELISA方法进行对比,结果表明试剂盒检测的阴性结果符合率为94.96%,阳性结果符合率为75.76%,比较两种方法符合率为91.05%。