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第一部分质子感知受体OGR1在椎间盘终板软骨细胞的表达及调控椎间盘终板软骨细胞的作用目的：研究大鼠椎间盘终板软骨细胞是否表达OGRl受体及其调控椎间盘终板软骨细胞的凋亡和代谢作用。方法：无菌分离约4周(160-200 g)大鼠腰椎终板软骨组织,采用胰蛋白酶消化30 min后,用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养大鼠腰椎终板软骨细胞以及传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,采取甲苯胺蓝及免疫组织化学染色(Ⅱ型胶原)对大鼠椎间盘终板软骨细胞表型进行鉴定。利用PT-PCR检测OGR1、G2A、GPR4及TDAG8四种质子感知受体mRNA在大鼠椎体终板软骨细胞的表达,细胞外酸化(pH 6.4)终板软骨细胞1h后,用real-time PCR从mRNA水平分析OGR1亚家族表达情况；用Western blotting从蛋白水平分析终板软骨细胞的OGR1表达情况；免疫荧光双标法检测OGRl在大鼠终板软骨细胞的定位情况。构建携带OGR1小发夹RNA (shRNA)的慢病毒载体,敲除终板软骨细胞OGR1。Cellular DNA fragmentation enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)测定不同pH浓度对终板软骨细胞凋亡率的影响。酸诱导软骨细胞1h后通过Annexin V-FITC/PI双染分析终板软骨细胞凋亡情况,通过透射电镜观察终板软骨细胞凋亡的形态学改变。用对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠椎体终板软骨细胞培养上清液中糖胺聚糖(GAG)的含量,氯胺T法检测培养上清液中羟脯氨酸(HYP)的含量,ELISA法和real-time PCR检测MMP-2、MMP-9、TIMPs-1和TIMPs-2的含量。用细胞免疫化学方法检测Ⅱ型胶原(CO Ⅱ)的变化,用Western blotting方法分析终板软骨细胞蛋白多糖聚糖体(aggrecan)的表达变化。结果：刚切开的大鼠终板软骨可见透亮软骨,酶消化分离的终板软骨细胞状态近似圆球状,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)均匀、有层次感。大鼠终板软骨细胞分离、原代与传代培养中,我们在倒置显微镜下观察,发现原代细胞大约24 h后大部分细胞贴壁,48 h后软骨细胞开始增殖加快,大约5-7 d后软骨细胞可传下一代。甲苯胺蓝染色结果可见大鼠终板软骨细胞质有蓝色异染出现；免疫组化染色显示培养的大鼠终板软骨细胞和细胞外基质中有Ⅱ型胶原表达。PT-PCR结果发现OGR1 mRNA在大鼠椎间盘终板软骨细胞有高水平表达,G2A和TDAG8 mRNA呈现低水平表达,GPR4 mRNA未见表达。real-time PCR显示OGR1 mRNA在酸(pH 6.4)诱导的大鼠椎间盘终板软骨细胞的表达显著增多,其它质子感知受体mRNA未见改变。Western blotting结果显示OGR1蛋白表达于大鼠终板软骨细胞,免疫荧光还显示OGR1蛋白表达于大鼠终板软骨细胞的细胞浆和胞膜。Western blotting结果显示慢病毒载体能有效沉默OGR1蛋白的表达,证实我们有效构建了OGRl-shRNA。DNA fragmentation ELISA结果显示在细胞外进行1h的酸诱导,细胞凋亡呈时间依赖性,18h终板软骨细胞凋亡最明显。Annexin V-FITC流式细胞和透射电镜进一步验证以上发现。通过OGRl-shRNA阻断OGR1能显著抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡(与对照组比较P<0.05)。细胞胞外pH 6.4酸诱导大鼠终板软骨细胞对GAG和HYP的分泌,抑制MMP-2、MMP-9、TIMPs-1及TIMPs-2的表达,而MMPs/TIMPs比率增强。敲除OGR1可有效阻断胞外酸化pH 6.4诱导GAG和HYP的分泌,抑制酸化pH6.4诱导MMP-2、MMP-9、TIMPs-1和TIMPs-2的表达降低,抑制MMPs/TIMPs比率的增强,也有效抑制pH 6.4诱导的细胞外基质(ECM)的降解。结论：大鼠椎间盘的终板软骨细胞内有OGR1的高表达。椎间盘终板软骨细胞表达OGR1,受到细胞外酸化的调节。酸激活的OGR1在椎间盘终板软骨细胞凋亡和细胞代谢过程中发挥调节性的功能。第二部分质子感知受体OGR1介导胞内ca2+水平调控椎间盘终板软骨细胞凋亡的作用机制目的：探讨质子感知受体OGRl介导胞内Ca2+水平调控椎间盘终板软骨细胞凋亡的分子机制。方法：大鼠腰椎终板软骨细胞以及传代培养。构建携带OGR1 shRNA的慢病毒载体,敲除终板软骨细胞OGR1。应用ca2+荧光探针Fluo-3/AM孵育培养的大鼠终板软骨细胞,采用激光共聚焦显微镜方法研究酸诱导的Ca2+荧光强度及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)动态变化,并检测特异性阻断OGR1、细胞外钙离子螯合剂(EGTA,50μM)、细胞内选择性钙离子螯合剂(BAPTA/AM,0.5 mM)和磷脂酶C (PLC)阻断剂U73122(10μM)以确定其对酸诱导胞内钙离子浓度变化的影响。用Cellular DNA fragmentation enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)测定钙离子信号通路中特异性阻断剂(BAPTA-AM,50 μM; EGTA, 0.5 mM; U73122,10μM;钙蛋白酶(calpain)抑制剂(calpeptin, 10μM);钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂(cyclosporine A,1μM);钙调激酶Ⅱ抑制剂(KN-93,1 μM)对酸诱导的终板软骨细胞凋亡率的影响。用Western blotting从蛋白水平分析钙敏感的蛋白酶calpain和calcineurin的表达以及下游相关凋亡蛋白如Bid、Bad、Caspase 3、poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)、caspase 3激活和PARP劈裂片段在酸pH6.4处理的OGR1-shRNA、NC-shRNA以及BAPTA-AM组不同时间点的表达。结果：激光共聚焦ca2+荧光实验显示pH 6.4的酸化明显诱导大鼠终板软骨细胞凋亡和[Ca2+]i的升高；shRNA阻断OGR1能够有效抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡和[Ca2+]i的增加。我们发现利用细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM,0.5 mM)螯合细胞内钙离子(ca2+)后,可以显著抑制酸(pH6.4)诱导的细胞内[ca2+]i升高,而细胞外的钙离子螯合剂的EGTA (50 μM)螯合了细胞外钙离子后,对抑制酸(pH6.4)诱导的细胞内[Ca2+]i升高不明显。[Ca2+]i升高主要是通过磷酸脂酶C(PLC)途径的激活,导致细胞胞内钙库内Ca2+的释放,从而提高细胞内游离的[Ca2+]i。研究发现PLC抑制剂U73122能显著抑制酸(pH6.4)诱导的细胞内[Ca2+]i升高,说明酸诱导的钙离子浓度升高是通过PLC途径。进一步研究发现10μMcalpeptin或1μM cyclosporine A能够显著抑制酸(pH6.4)诱导的终板软骨细胞凋亡率,而钙调节酶Ⅱ抑制剂KN-93对酸(pH6.4)诱导的终板软骨细胞凋亡未见显著抑制作用,以上结果说明酸诱导的终板软骨细胞凋亡是依赖于钙敏感的蛋白酶calpain和calcineurin途径,而非依赖于钙调激酶Ⅱ途径。Western blotting实验结果显示,与正常对照比较,calpain和calcineurin蛋白在酸(pH6.4)组的表达显著增加,通过shRNA阻断OGR1后,显著抑制酸(pH6.4)诱导的蛋白酶calpain和 calcineurin的蛋白表达,而对照NC-shRNA组calpain和calcineurin的蛋白表达未见明显改变,说明OGR1介导胞内Ca2+水平调控椎间盘终板软骨细胞凋亡是通过.Ca2+敏感的蛋白酶calpain和calcineurin信号途径。下游相关凋亡蛋白Bid在酸诱导4h后,与0h比较表达显著增加；与0h比较酸诱导8h Bad蛋白的表达显著增加；caspase 3激活和PARP劈裂片段在酸诱导4h后,蛋白表达显著增加。细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM,0.5 mM)螯合细胞内钙离子(Ca2+)后,Bid、Bad、Caspase 3、PARP、Caspase3激活和PARP劈裂片段在酸(pH6.4)处理后,蛋白的表达与对照组比较未见显著改变(P>0.05)。与BAPTA/AM相似,OGRl-shRNA也抑制酸诱导的Bid、Bad、Caspase 3、PARP、Caspase3激活以及PARP劈裂片段蛋白水平的表达。结论：OGR1介导的酸诱导椎间盘终板软骨细胞凋亡是通过激活ca2+敏感的蛋白酶和下游信号Bid、Bad、Caspase 3、PARP和caspase 3通路。