【摘 要】
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背景及目的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是指除外饮酒因素或其他有明确肝损伤因素的炎性脂肪肝病,它是一种临床常见的疾病。NASH具有肝细胞肿胀、脂肪变性及炎症损伤的特点,可伴有肝纤维化及肝硬化,可进展成肝癌甚至肝衰竭。随着生活水平提高及生活方式等方面的改变,NASH的发病率也越来越高。NASH早期并无明显的临床表现,由于确诊方式（病理活检）
【基金项目】
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高等学校学科创新引智计划（“111计划”）,项目名称:肝脏损伤与修复基础及临床应用研究,项目合同编号:D17011,项目起止时间:2017年6月-2022年5月； 国家自然科学基金重大研究计划培育项目,项目名称:肝脏衰老及再生障碍的补体依赖性机制与调控,项目合同编号:91949122,项目起止时间:2020年1月-2022年12月；
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背景及目的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是指除外饮酒因素或其他有明确肝损伤因素的炎性脂肪肝病,它是一种临床常见的疾病。NASH具有肝细胞肿胀、脂肪变性及炎症损伤的特点,可伴有肝纤维化及肝硬化,可进展成肝癌甚至肝衰竭。随着生活水平提高及生活方式等方面的改变,NASH的发病率也越来越高。NASH早期并无明显的临床表现,由于确诊方式（病理活检）的有创性,大多数患者难以接受导致NASH的检出受限,当NASH确诊时常常已经进展为肝硬化、肝癌等晚期肝病。目前尚无药监局批准的药物治疗NASH,所以寻找有效的NASH的防治方式尤为重要。甘氨酸转运RNA衍生片段（glycine transfer（t）RNA-derived fragments,Gly-tRF）是一种非编码小RNA,它是病理应激下,转运RNA被特异性切割产生的片段。有研究表明tRF可以通过抑制蛋白质合成或与m RNA竞争核糖体的结合位点来导致疾病的发生。我们发现Gly-tRF在西方饮食诱导的小鼠NASH模型中表达升高,但Gly-tRF在小鼠非酒精性脂肪性肝炎进展中的作用和机制尚不清楚。本研究旨在探讨Gly-tRF在NASH中的功能及其分子机制,为NASH寻找潜在的治疗靶点。方法首先,C57BL/6J小鼠通过西方饮食饲料喂养12周建立小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型。小鼠的肝组织进行H＆E,油红O染色,分析肝细胞脂肪变性及脂质淤积;检测小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血清及肝组织中的甘油三酯、总胆固醇;定量荧光PCR法检测小鼠肝组织中Gly-tRF的表达情况。接着用AML-12细胞在油酸和棕榈酸的刺激下建立了肝细胞脂质淤积模型,检测Gly-tRF的表达情况。在肝细胞脂质淤积模型中,我们将Gly-tRF反义抑制剂及其对照物处理AML-12细胞,将细胞进行油红O染色观察病理变化,测量了细胞中的TG含量,并用定量RT-PCR检测了脂质合成相关基因的表达。在小鼠NASH模型中,用化学修饰Gly-tRF反义抑制剂及其对照物处理小鼠,并进行了相关指标的检测:如H＆E及油红O染色、血清肝功能、肝组织中TG、CHO的含量、在m RNA及蛋白水平检测了脂质合成相关基因及炎症因子的表达,以探究Gly-tRF在小鼠非酒精性脂肪性肝炎中的作用。最后,将Gly-tRF反义抑制剂处理的小鼠肝组织进行高通量测序,分析差异表达的基因,结合GO分析预测可能的通路并验证,进而探究Gly-tRF在小鼠非酒精性脂肪性肝炎进展中的作用及分子机制。结果1.Gly-tRF在小鼠非酒精性脂肪性肝炎肝组织中的表达:（1）相较于对照组,Gly-tRF在西方饮食诱导的小鼠NASH模型及肝细胞脂质淤积模型中表达升高。（2）肝细胞脂质淤积模型中,用油红O染色,相较于对照组细胞,抑制剂处理的AML-12细胞脂质淤积减轻,细胞中的TG下降,细胞中脂质合成相关基因的表达下调。2.Gly-tRF在小鼠非酒精性脂肪性肝炎中的作用:（1）在小鼠NASH模型中,相较于用正常组小鼠,用Gly-tRF抑制剂处理小鼠后,肝组织的H＆E及油红O染色结果表明小鼠肝脏中脂滴变小数量减少,肝细胞脂肪变性减轻。（2）血清中ALT、肝组织中的TG、CHO降低。（3）脂质合成相关的关键酶在m RNA及蛋白水平均显著降低。（4）炎症因子在m RNA水平的表达也显著降低。3.抑制Gly-tRF减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎的分子机制:（1）将Gly-tRF抑制剂及对照组的小鼠NASH模型中肝组织进行高通量测序后,发现差异表达的脂代谢相关基因大多集中在PPAR-γ信号通路中,而差异表达的炎症相关的基因大多集中在Inflammatory mediator regulation of TRP channels通路中。（2）将通路中的部分关键基因进行验证,发现PPAR-γ、CYP4a10、CYP2E1、ACAA1b、IL-1β的表达降低。结论NASH小鼠肝组织中Gly-tRF表达升高;抑制Gly-tRF通过调控PPAR-γ和Inflammatory mediator regulation of TRP channels信号通路减轻肝组织脂肪变和炎症反应。Gly-tRF抑制物有望成为治疗NASH新的靶点。
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