杜氏盐藻是一种能在0.5～5M NaCl盐浓度下生存的真核无细胞壁单细胞具有双鞭毛的藻类生物,其对生长条件要求比较简单且相对容易培养。它具有的等长鞭毛长度大约13μm,该鞭毛结构为典型的“9+2”结构。杜氏盐藻鞭毛经过机械法或者醋酸等简单处理后脱掉的鞭毛可发生再生和重吸收现象。实验室中在光学显微镜下很容易观察到杜氏盐藻鞭毛的形态变化,其直观的形态结构非常适合作为研究鞭毛结构组装和纤毛相关性疾病研究的模式生物。鞭毛/纤毛是一种在多种低等动物或高等动物细胞表面存在的一种特殊细胞器,它不仅参与细胞通讯和细胞信号转导、细胞周期调控,还参与细胞运动等细胞功能,这些功能对维持细胞正常生理活动至关重要。已有的研究表明鞭毛/纤毛的结构和调控异常与多种人类疾病的发生密切相关,如组织的左右不对称、Kartagener综合症、多囊肾、多指/多趾等。因此研究鞭毛/纤毛的调控机制对解决这些疾病的发生和发病机制具有重要的生命意义。目前,人们对鞭毛/纤毛的组装调控机制的研究还处于初级阶段,对鞭毛/纤毛参与相关生命调控的具体过程尚不明了。现已有的研究显示鞭毛/纤毛的组装是一个双向的运输的过程,既正向运输与逆向运输在同一时期进行物质运输。鞭毛/纤毛的组装是由鞭毛内转运颗粒(Intraflagellar transport, IFT)调控的,IFT颗粒作为运输体,能够将鞭毛组装过程所需要的“cargo”即货物运输到鞭毛组装部位。鞭毛有动力蛋白和驱动蛋白两个马达蛋白：在驱动蛋白ATP酶水解能量的驱动下,使货物载体沿细胞骨架微管蛋白从基底部运送至鞭毛顶端,在鞭毛的正向端卸下货物,用来组装微管。IFT运载体颗粒在鞭毛正向顶端部位回转,将微管解聚后的物质在动力蛋白作用下沿细胞骨架微管回到鞭毛基部。也就是说,鞭毛的长度是个动态再生和重吸收的变化过程,即呈现踏车现象。当IFT运载体在鞭毛上的正向端的运输货物的速率大于逆向运输货物的速率时,鞭毛长度呈现增长的趋性,即为鞭毛再生过程。反之,当逆向运输速率大于正向运输速率时,有利于鞭毛解聚过程,即为鞭毛重吸收过程。研究表明在细胞分裂过程中,鞭毛长度会发生周期性的再生与重吸收,鞭毛长度的变化可能作为细胞周期调控的信号外在表现。在其他的一些纤毛相关性疾病中,能观察到鞭毛长度变化的异常现象。鞭毛内颗粒IFT从鞭毛的基体沿着微管丝向鞭毛正向端的顶端部运输属于正向运输,这一过程是由驱动蛋白kinesin-2介导完成的,而由鞭毛正向顶端部向基体的逆向运输是由动力蛋白dynein介导运输完成的。因此,驱动蛋白-2是作为驱动蛋白家族的一员,是一个对鞭毛的组装有重要作用正末端指向的驱动蛋白。驱动蛋白-2的结构是有两个轻链和两条重链组成的四聚体,从外观看具有两个球形的头部、中间的一个螺旋状的杆和两个呈现扇子状的尾。微管马达蛋白通过结合和水解ATP得到能量,导致结构的颈部发生构象改变,使两个头部相互交替地与微管结合,从而使马达蛋白沿微管“行走”,将结合的“货物”转运到其他地方。在低等生物和高等生物中都存在Kinesin-2,但其命名不同。在高等生物人类及鼠类中命名为KIF3A和KIF3B/KIF3C的两个动力结合区域和一个非动力结合性驱动蛋白KAP3亚基单位。而Kinesin-2在藻类等低等生物中命名为FLA8和FLA10动力蛋白亚基和一个非动力蛋白亚基,即结合蛋白亚基KAP。本研究是在FLA8已研究的基础上,以GenBank上登录的序列设计引物克隆了FLA8基因cDNA的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),构建了原核表达载体pET28a-FLA8,并诱导其在大肠杆菌BL21中表达,经纯化获得高纯度的FLA8蛋白。通过应用高纯度的FLA8蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得了兔抗FLA8的特异性多克隆抗体。利用多克隆抗体检测了杜氏盐藻在盐脱鞭毛后及鞭毛再生过程中FLA8的表达变化。为进一步研究FLA8是否具有其同源基因KIF3B的功能,首先构建了荧光定位载体pEGFP-N1-FLA8,并将pEGFP-N1-FLA8转食管鳞癌细胞EC9706中,并在荧光显微镜下进行观察FLA8在细胞中的定位情况。方法1第一章FLA8多克隆抗体的制备1.1FLA8开放阅读框的扩增根据GenBank登录的FLA8的cDNA序列设计特异性引物。提取杜氏盐藻中总的RNA为反转录的模板,转录成cDNA后,以cDNA为模板,扩增FLA8的开放阅读框,将其连接到pMD-T载体上,转化后测序的结果与GenBank上的cDNA序列比对。1.2FLA8基因原核表达载体的构建用限制性内切酶Ndel和Hindlll对所提取的质粒进行切割,切下来的目的基因插入到pET28a(+)中,构建原核表达载体pET28a-FLA8并鉴定序列的正确性。1.3pET28a-FLA8在大肠杆菌BL21中的诱导表达和纯化鉴定正确的pET28a-FLA8重组质粒转化到制备好的大肠杆菌感受态细胞BL21中,扩大培养后经IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳鉴定诱导蛋白的情况。根据实际的情况对诱导的条件进行优化,使蛋白质的表达量达最大,由于表达的蛋白质是包涵体,因此优化表达条件后,收集包涵体沉淀,处理后通过Ni-NTA-琼脂糖纯化柱纯化出FLA8的融合蛋白。1.4FLA8多克隆抗体的制备将纯化后的FLA8蛋白与佐剂乳化后,免疫新西兰白兔,通过多次免疫后分离抗血清,获得高效价和特异性的抗体。第二章杜氏盐藻鞭毛再生过程中FLA8的表达变化将生长在对数期的杜氏盐藻进行脱鞭毛处理,然后,每半小时提取杜氏盐藻细胞的总的蛋白质,收集不同鞭毛生长时间内的总蛋白,用制备好的杜氏盐藻FLA8多克隆抗体进行Western blots方法检测不同时间段下FLA8的蛋白表达情况。第三章杜氏盐藻FLA8基因在食管鳞癌细胞EC9706细胞中的定位2.1FLA8基因的克隆与荧光载体pEGFP-N1的连接设计带有不同酶切位点的特异性引物,以cDNA为模板,扩增带有酶切位点的FLA8基因的开放阅读框。然后与用相同酶酶切过的荧光表达线性载体pEGFP-N1定向的连接构建成重组载体。2.2转染过程将正常条件下培养的食管鳞癌细胞EC9706经胰蛋白酶消化后接种于6孔板中培养,按脂质体Lipofectamine TM2000转染试剂说明书将真核表达/定位载体pEGFP-N1-FLA8转染到6孔板中培养,空表达载体pEGFP-N1作为阴性参照。2.3用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位情况重组载体pEGFP-N1-FLA8转染到EC9706细胞24-48h后,在荧光显微镜/照相系统下观察融合蛋白在细胞中的定位情况。结果1第一章FLA8多克隆抗体的制备1.1FLA8开放阅读框的扩增用试剂Trizol提取盐藻总RNA,经电泳检测28S和18S条带清楚,纯度较高,且亮度几乎是2：1,达到了实验要求。利用RT-PCR扩增方法得到2355bp的FLA8的开放阅读框。经BLAST分析,与GenBank上登录的FLA8序列ORF同源性一致。1.2FLA8基因原核表达载体的构建用限制性内切酶NdeI和HindⅢ对所提取的重组表达载体质粒进行双酶切切割可以得到一条约2500bp和5000bp的条带,胶回收最接近FLA8开放阅读框大小的条带,经测序鉴定与GenBank登录的FLA8基因的开放阅读框的基因序列完全一致。表明成功构建了原核表达载体pET28a-FLA8。1.3pET28a-FLA8在大肠杆菌BL21中的诱导表达和纯化构建好的表达载体转化大肠杆菌BL21中,诱导剂IPTG诱导菌株表达,经SDS-PAGE检测发现与对照菌株相比在94kDa处有一条明显的蛋白质条带,其大小与预测带有HIS标签的FLA8大小一致,这就证明了FLA8重组蛋白表达成功。预测FLA8表达的结果是包涵体,表达出来的包涵体经过洗涤、溶解处理后,由Ni-NTA-琼脂糖纯化柱纯化,经SDS-PAGE分析表明所得到的蛋白质的纯度高达95%。1.4FLA8多克隆抗体的制备通过多次抗原免疫后分离抗血清,获得高效价和特异性的抗体,间接ELISA法测定抗血清效价比较高,符合做抗体的需求；Western blots同样验证了抗体的特异性。第二章杜氏盐藻鞭毛再生过程中FLA8的表达变化杜氏盐藻中FLA8的蛋白表达量在杜氏盐藻总蛋白中是相对比较少,通过制备的FLA8多克隆抗体作为一抗进行Western blots分析,结果显示鞭毛在生长过程中FLA8的表达量相对于去掉鞭毛时总体呈现增加的趋势。第三章杜氏盐藻FLA8基因在食管鳞癌细胞EC9706细胞中的定位3.1FLA8基因的克隆与荧光载体pEGFP-N1的连接通过已知的序列设计特异性引物扩增目的条带,所扩增的结果与该已知的序列比较完全一致。用相应的限制性内切酶对构建好的重组载体双酶切,得到的目的片段同样与已知序列的开放阅读框是一致的。3.2重组载体pEGFP-N1-FLA8表达的蛋白在细胞内的定位将空质粒pEGFP-N1和构建成功的重组质粒载体pEGFP-N1-FLA8转染食管鳞癌细胞EC9706,24-48h后在荧光显微镜下观察。转染空质粒载体pEGFP-N1的细胞中绿色荧光分布在整个细胞质中,而转染pEGFP-N1-FLA8重组质粒的细胞中绿色荧光都定位于细胞核中。结论本研究诱导出融合蛋白作为抗体在蛋白质水平证明了FLA8基因参与了鞭毛的再生过程,并将FLA8基因转染食管鳞癌细胞EC9706后观察到杜氏盐藻FLA8基因定位于中心体上。