第一部分磨损颗粒导致小鼠假体松动的动物模型的建立研究背景关节置换手术已经成为治疗严重关节炎最成功最有效的方法,尽管关节假体的材料和设计一直在改进,但是无菌性松动仍然是最常见的并发症,并且发病率较高。由于在关节假体周围注射药物及保持药物有效浓度方面仍有困难,所以治疗假体周围无菌性坏死仍是个难题。尽管无菌松动的具体病理过程尚未完全清楚,但是越来越多的研究表明假体因机械磨损所产生的生物材料颗粒在此过程中起了重要作用。磨损颗粒被巨噬细胞吞噬后不能被酶彻底消化,从而阻断了这些炎性细胞的降解作用。重复地吞噬磨损颗粒造成了炎性细胞的活化,产生大量既破坏骨和软骨又能激活更多的免疫细胞的促炎因子和蛋白水解酶。细胞因子的大量产生能够引起炎性反应的持续刺激,产生慢性炎症和组织破坏,导致关节假体周围的骨溶解及假体松动。因此解决磨损颗粒导致的假体松动已经成为重要的研究方向。由于关节的解剖特性,假体周围给药困难并且药物的有效浓度难以维持,因此治疗磨损颗粒导致的假体松动仍然比较麻烦。当进行抗炎或者抗骨溶解药物治疗时,关节周围的药物浓度依靠血管的灌注,提示需要较高的全身药物浓度来保证局部关节的有效浓度,而较高的全身药物浓度通常导致严重的副反应和并发症。基因治疗方法虽然处于早期,仍可成为解决假体无菌松动的一个具有吸引力的选择。为研究假体无菌松动的发生机制并探索新颖的治疗方法,合适的动物模型是不可缺少的。我们曾经开发了气囊大鼠模型并取得了很多重要的研究成果,比如OPG基因对磨损颗粒导致的骨溶解的治疗效果,但是这个模型本身也存在很多缺陷,例如只能进行短期研究和不适合假体植入等,这就影响了对假体生物力学稳定性、无菌松动的长期治疗效果和安全问题等的研究。目前对于假体-骨／假体-骨水泥的粘合研究以及对假体无菌松动发病机制的研究都是使用了狗、羊和兔等大动物模型。尽管这些大动物具有可以使用真正假体的优势,但是花费较高、不易于饲养、样本量低、伦理问题尤其是研究治疗方法等因素都阻止了这些大动物的应用。因此我们打算建立一个新颖的动物模型,即在小鼠的膝关节植入钛钉模拟关节假体置换手术,植入钛钉前在假体周围界面放入磨损颗粒,建立真正意义上的关节假体松动模型。Lac-Z基因是目前常用的检测病毒转染成功的措施,在假体松动动物模型的基础上我们应用Lac-Z基因检测基因治疗的可行性。目的调查建立适于长期研究的小鼠假体松动动物模型的可行性,研究假体松动的病理过程,并检测基因治疗的可行性。材料与方法1.动物54只雌性八周龄的BALB／c小鼠作为假体松动模型的宿主,分为钛颗粒组(18只)、对照组(18只)和LacZ基因转导组(18只)。实验开始之前隔离至少一周时间。2.假体松动模型的建立小鼠麻醉后在无菌条件下,沿左髌韧带内侧纵行切开,显露胫骨平台,刮除胫骨平台软骨,0.7mm的钻头从胫骨平台中央垂直钻入5mm,植入钛钉,对于钛颗粒组小鼠在植入钛钉之前向胫骨髓腔注入10μl钛颗粒悬浮液且术后每月注射20μl钛颗粒悬浮液至关节腔,而对照组的小鼠髓腔则不注入钛颗粒,以PBS代替。用含有青霉素和链霉素的PBS冲洗伤口后缝合,术后3、7、12周处死小鼠,进行拔钉实验和组织学检测。3.病毒载体和LacZ基因的体内转移腺相关病毒(AAV)为LacZ基因的载体,以检测基因治疗的可行性。术后3周,将50μl无菌培养液(AAV-LacZ浓度为5×108IU／ml)注射到小鼠假体关节腔内,共计12只,其余6只注射不含病毒的培养液。术后7、12周处死小鼠行膝关节X-gal染色,检测LacZ基因产物表达的效果。4.MicroCT测评应用MicroCT观察钛钉植入的位置是否合适。手术当天以及第3、7、12周各扫描一次。采集MicroCT图像后对假体周围的胫骨骨密度(BMD)进行测量。5.拔钉实验术后第3、7、12周处死小鼠,从假体关节处行膝关节离断,去除假体周围的软组织显露钛钉帽,将假体及胫骨通过牙科粉置于固定架上,假体钉帽置于固定架的夹持刀片中间,将固定架与MTS机器相连,以2.0mm／min的速度进行牵拉,并对输出的数据进行分析处理。6.组织学和免疫组织学检查拔钉实验后收集胫骨近端的组织。应用福尔马林缓冲液固定,12%EDTA脱钙,石蜡包埋。苏木精-伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察新生骨或者骨质破坏,并使用Image-Pro软件计算假体和胫骨之间界膜的厚度。改良的Masson三色染色法观察骨胶原的变化。应用免疫组织化学的抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC法)检测IL-1,TNFα和CD68的表达。X-gal染色检测LacZ基因的表达。7.统计学分析SPSS软件包对各组实验数据进行t检验或方差分析并进行多重比较。p＜0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。结果1.手术结果小鼠耐受手术良好,术后3天开始患肢行走,一周后伤口愈合,缝线脱落,无红肿、渗出等感染征象。颗粒组和其余两组的小鼠在日常行为上无明显区别。离断膝关节后可在假体周围及膝关节观察到分布不均的钛颗粒,大体观察见三组小鼠无明显的解剖结构变化。2.MicroCT检测对照组术后12周,MicroCT显示钛钉位置良好,无松动迹象。而钛颗粒组在第7周出现钛钉周围BMD的明显降低,提示钛颗粒导致假体松动(p＜0.05)；钛颗粒组在第12周时钛钉周围BMD降低较对照组更加明显(p＜0.01)。3.假体稳定性检测用牙科粉将小鼠下肢远端固定,近端假体钉帽固定在于机器相连的夹持刀片中间,夹持刀片至少能承受100牛顿的拉力。对照组术后12周钛钉拔拉力量的平均峰值为24.12±3.3牛,术后第3、7、12周之间没有明显统计学差异。而钛颗粒组在第7周出现明显的拔拉力量下降(p＜0.05),至术后第12周仅为4.32±0.55牛(p＜0.01)。4.组织学和免疫组织化学评估对照组的组织学切片显示了良好的假体稳定状态,可见不规则的新生骨形成。相反,钛颗粒组由于钛颗粒的刺激,可以观察到假体和骨质之间的炎性软组织-假膜的形成,术后第7、12周的假膜厚度明显高于钛颗粒组(p＜0.01)。钛颗粒组的钛钉-骨界面Masson染色与对照组相比,浅而模糊,提示钛颗粒组骨胶原丢失。在第7周钛颗粒组较对照组骨胶原丢失达到47.66±5.21%(p＜0.01),第12周胶原丢失达到52.29±6.72%(p＜0.01)。实验显示,从第7周开始伴随钛颗粒的注射,假体松动是一个连续的炎症细胞浸润和假体-骨界膜形成的过程。免疫组织化学染色显示,钛颗粒刺激的假体周围IL-1和TNFα表达增加,提示炎症参与了该病理生理过程；CD68阳性细胞表达较对照组增多,表明破骨前体细胞生成增多。5.LacZ基因产物的检测X-gal染色膝关节,着色深蓝或者暗绿色,提示注射入小鼠膝关节的AAV-LacZ具有较强表达。而无病毒组染色阴性。结论1.成功建立了小鼠膝关节假体松动模型Pin-model,模拟了临床假体磨损颗粒诱导松动的过程。2.假体松动是一个慢性持续性的过程,伴随炎症细胞的浸润和炎性假膜的形成、破骨细胞的激活并导致骨质破坏,最终形成假体松动。3.AAV-LacZ病毒体内转导表达成功,确保了基因治疗的可行性。第二部分细胞介导的骨保护素基因治疗对磨损颗粒导致的小鼠假体松动作用的研究研究背景关节置换术是治疗严重骨关节炎非常成功的方法,近年来由于手术感染或者失误所导致的手术失败已经大大减少,而无菌性假体松动已经成为假体置换最常见的并发症,并成为假体远期成功所面临的一个难题。在所有引起人工关节松动的因素中,磨损颗粒引起的周围组织反应是尤为重要的一个因素。假体因机械磨损所产生的颗粒被巨噬细胞和其它炎性细胞吞噬,进一步激活炎性细胞并导致促炎症因子的释放,如IL-1,TNFα和IL-6。这些细胞因子反过来又激活细胞的增殖,造成局部组织的炎症反应,促进破骨细胞形成并吸收假体周围骨组织。影响新生骨的形成和重塑,导致骨溶解,最终形成假体松动。近年研究发现,OPG/RANKL/RANK系统在骨组织代谢和骨溶解过程中起了非常重要的作用。核激活因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor NF-κB ligand, RANKL)由巨噬细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞表达,与破骨细胞或者破骨前体细胞表面的RANK结合后促进破骨细胞的增殖、分化,并导致局部的骨溶解。而成骨细胞或者骨髓基质细胞分泌表达的骨保护素(osteoprotegerin, OPG)与RANKL竞争性结合,阻止RANK和RANKL之间的结合,从而阻断破骨细胞的分化和成熟。由于OPG具有抗骨溶解的特性,已经成为治疗磨损颗粒导致的骨溶解和假体松动的一种潜在治疗剂。但是如何将OPG导入松动假体周围仍然是个棘手的问题。当前系统的抗骨溶解和抗炎治疗有很多缺点,比如需要维持较高的全身浓度才能达到合适的局部浓度、全身的副反应和患者较差依从性。基因治疗尽管还处在初级阶段,但是能保持局部治疗蛋白的持续释放,已经成为了治疗假体无菌松动的一个非常有吸引力的选择。我们已经成功通过体内基因转移技术将腺相关病毒AAV携带的OPG基因转染到术肢体内。为了更好地控制转基因表达的效率并与体内基因转移相比较,本实验拟在成功建立的Pin-model小鼠模型上评价细胞介导的OPG基因治疗假体无菌松动和骨溶解的效果。目的1.调查编码OPG基因的腺相关病毒针对小鼠成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的体外转染效率。2.在新Pin-model小鼠模型的基础上,检测FLS介导的OPG转基因治疗小鼠假体松动的有效性和可行性。3.探讨FLS-AAV-OPG体外基因治疗的作用机制。材料和方法1.成纤维细胞样滑膜细胞将10只雌性八周龄的BALB/c小鼠引颈处死,酒精消毒双下肢,显露双膝关节。剔除膝关节周围的肌肉,收集膝关节周围的滑膜组织,PBS冲洗后剪碎,放入含有1mg／ml胶原酶的RPMI 1640培养液中,37℃孵育2小时。通过尼龙筛过滤、反复多次冲洗,将过滤液以1500转／分钟的速度离心8分钟,去除上清液,将FLS细胞放入含10%FBS和1%青霉素／链霉素的RPMI1640培养液中培养,放置在5% CO2培养箱,培育温度37℃。第二天换液后继续培养,长至融合状态时按照1：5比例传代继续培养。2.基因转染细胞编码OPG基因的腺相关病毒和编码LacZ的腺相关病毒针对FLS细胞进行体外基因转导。当细胞融合度达到30-40%时,将50μl的109cfuAAV-OPG-GFP(或AAV-LacZ)和5ml新鲜培养液加入FLS细胞；37℃孵育8个小时后第二次加入同样剂量的上述转导液继续培养。绿色荧光显微镜检测OPG-EGFP基因的转导效率；X-gal染色测定转导细胞中LacZ基因的表达及转导效率。3.假体松动动物模型的建立60只雌性八周龄的BALB/c小鼠分为五组：AAV-OPG, FLS-AAV-OPG, AAV-LacZ, FLS-AAV-LacZ和PBS对照组。实验开始之前小鼠隔离至少一周时间。小鼠麻醉后在无菌条件下,沿左髌韧带内侧纵行切开,显露胫骨平台,刮除胫骨平台软骨,0.7mm直径的钻头从胫骨平台中央垂直钻入约5mm,植入钛钉,在植入钛钉之前向胫骨髓腔注入10μl钛颗粒悬浮液且术后4周注射20μl钛颗粒悬浮液至关节腔。术后第3周,将50μl分别含有AAV-OPG、AAV-LacZ的无菌培养液(106IU／ml),50μl分别含有FLS-AAV-OPG、FLS-AAV-LacZ的培养液(106个／ml)及50μl的PBS注射到小鼠的左膝关节腔。基因治疗4周后处死小鼠,进行生物力学、组织学及分子生物学的检测。4.拔钉实验基因治疗后4周处死小鼠,从假体关节处行膝关节离断,去除假体周围的软组织显露钛钉帽,将假体及胫骨通过牙科粉置于固定架上,假体钉帽置于固定架的夹持刀片中间,将固定架与MTS机器相连,以2.0mm／min的速度进行牵拉,并对输出的数据进行分析处理。5.组织学和免疫组织学检查拔钉实验后收集胫骨近端的组织。应用福尔马林缓冲液固定,12%EDTA脱钙,石蜡包埋。苏木精-伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察新生骨或者骨质破坏,并使用Image-Pro软件计算假体和胫骨之间界膜的厚度。改良的Masson三色染色法观察骨胶原的变化。应用免疫组织化学的抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC法)检测IL-1,TNFα和CD68的表达。X-gal染色检测LacZ基因的表达。6. TRAP染色检测破骨细胞将胫骨近端组织的石蜡切片脱蜡后微波30秒,使用TRAP试剂盒对切片进行固定和染色。假体周围假膜细胞胞浆的紫色染色为TRAP阳性细胞。7.OPG转基因及其表达产物的检测常规的RT-PCR检测基因治疗部位及其它远处器官中OPG基因的表达。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳观察其大小。FLS-AAV-OPG培养液中OPG蛋白及左胫骨假体周围组织中OPG蛋白的浓度使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测。8.统计学分析SPSS软件包对各组实验数据进行t检验或方差分析并进行多重比较。p＜0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。结果1.细胞培养结果细胞主要呈梭形和多边形,大小不等。AAV-OPG转导的FLS细胞和AAV-LacZ转导的FLS细胞形态和增殖能力同未转导的细胞一致,未观察到急性细胞毒性的现象发生。2.转基因效率绿色荧光显微镜观察与AAV-OPG-EGFP共转染的EGFP基因产物绿色荧光蛋白的显色,显示AAV-OPG-EGFP转染FLS细胞的效率为93.1±2.2%；采用X-gal染色的LacZ转导FLS细胞显示强力的蓝染,证明转染成功并且平均转导效率为92.6±2.6%。3.拔钉实验用牙科粉将小鼠下肢远端固定,近端假体钉帽固定在于机器相连的夹持刀片中间,夹持刀片至少能承受100牛顿(N)的拉力。AAV-LacZ、FLS-AAV-LacZ及PBS对照组的拔钉力量平均峰值分别为10.34±2.05、8.14±1.23和7.32±1.35牛,三组之间没有统计学意义。而AAV-OPG和FLS-AAV-OPG组拔钉力量的峰值分别为21.56±2.44和18.19±2.10牛,两组之间没有统计学差异,但是对于其它三组均具有统计学差异(p＜0.05)。4.组织学分析FLS-AAV-LacZ及PBS对照组可以观察到假体-骨界面的假膜组织明显增厚,而FLS-AAV-OPG治疗组的假膜组织较薄,与OPG治疗组相比具有统计学意义(p＜0.01)。Masson染色显示AAV-LacZ组、FLS-AAV-LacZ组及PBS组均较OPG治疗组浅而模糊,IOD值具有统计学差异(p＜0.01)。免疫组织化学显示FLS-AAV-OPG治疗组TNFα、IL-1和CD68阳性细胞在界膜有较多聚集,而OPG治疗组的表达减少。5.TRAP+细胞经FLS-AAV-OPG治疗后的TRAP染色显示破骨细胞为紫红色,聚集在假体-骨界面的破骨细胞非常稀少,而在FLS-AAV-LacZ和PBS对照组破骨细胞明显增多(p＜0.01)。6.OPG基因及蛋白检测常规PCR显示除了FLS-AAV-OPG治疗组的假体关节组织中有OPG基因的表达,其余远处器官中均未发现OPG基因的表达,与AAV-OPG治疗组结果相同。ELISA实验测定细胞培养液中OPG基因转导产物的含量。病毒转导后24h检测到了OPG的表达,72小时内转基因产持续增高表达,在第72小时达到4.20ng/72/106个细胞。FLS-AAV-OPG治疗组的假体周围组织中的OPG浓度为2.60ng／mg,与AAV-OPG治疗组处于同一个水平。结论1.细胞介导的OPG基因在能够在小鼠Pin-model内成功表达,能达到有效的治疗浓度。2.OPG基因的表达对磨损颗粒诱导的骨质吸收和假体松动具有显著的治疗作用。3.OPG基因表达能够增加假体周围OPG蛋白的水平,阻断破骨细胞的激活,减少假体周围的炎症因子的表达。