背景先天性膈疝(Congenital diaphragmatic hernia, CDH)是由于先天性发育异常而导致膈肌缺损,腹腔脏器疝入胸腔,引起一系列病理生理变化,对心肺功能、全身状况均造成不同程度的影响,是新生儿急危重症之一,其发病率为1：2000-5000。尽管近年来对CDH的认识及治疗水平有所提高,其病死率仍较高,达到40%-60%,其主要死亡原因是肺发育不良。然而,CDH肺发育不良的发病机制尚未清楚,仍缺乏行之有效的治疗手段,因此,对该方面的研究已日益成为国际小儿外科领域的热点和难点。肺的发育是一个受到精确调控的复杂过程,包括细胞发育、增殖、分化以及细胞凋亡,也是细胞与细胞、细胞与间充质以及上皮与间质之间相互作用复杂过程。这个过程涉及到众多生物活性分子,包括生长分子、转录因子、细胞外基质分子等,它们形成相互作用的强大网络,在各个发育时期调控肺的发育。最近的研究发现一类新的非编码RNA微小RNA (microRNA, miRNA)也参与肺的发生发育过程。miRNA是一类长度为18-25核苷酸的单链非编码小RNA分子,主要通过碱基互补配对的方式与特异性靶基因信使RNA(mRNA)的3’UTR非翻译区结合,从而降解靶mRNA或抑制蛋白质的翻译合成,实现对靶基因转录后水平的调控。miRNA具有高度的保守性,普遍存在于真核细胞内,几乎参与了各类生物学过程,据估计,它们调控着人类近60%的基因,在发育和疾病发生过程中均起到关键作用。miRNA分子的功能不断被挖掘、被发现,miRNA已成为基因调控体系中的重要层面。如果从单一生物活性分子来阐明CDH肺发育不良的发病机制,往往比较片面,但既往的检测手段难以帮助研究人员在短时间内进行大量生物学数据的筛选和鉴别。随着现代科技的迅猛发展,生物芯片及生物信息学的兴起,可为揭示大量而复杂的生物数据所赋予的生物学奥秘提供了新的方法,为我们全面、快速研究CDH肺发育不良提供了更有效的手段。生物芯片是生命科学领域的一项重要的技术平台,极大加速和推动疾病的致病基因发现、早期诊断、分子分型、预后评估及药物研究等领域的发展。生物芯片具有高通量和快速测量等优点,它可产生海量的、复杂的生物信息数据,但是,如何解读芯片大量基因点的杂交信息,揭示其中蕴含的生命特征和规律,己成为基因芯片技术应用和发展的主要研究内容。生物信息学的出现,为解决这些生物数据提供一种新的思路和方法。生物信息学是一门新兴的学科,它综合运用数学、计算机科学和生物学等多学科知识和工具,阐明和揭示大量数据所包含的生物学意义。随着基因芯片和生物信息学的出现,药物发现模式发生了重大变革,由既往偶然发现、工业合成有效成份的传统时代进入了一个以基因为基础的药物研发新阶段。近年来,基因表达谱在药物研究方面的应用越来越广泛,研究人员构建了与活性化合物或药物相关的基因表达谱数据库,绘制了“基因-疾病-药物”之间的关系图。这些“联系图”为药物发现及研究提供新思路,形成一种独特的药物发现新模式,即基于化合物或药物基因表达谱的药物发现模式,通过该方法可筛选到一些疾病治疗候选化合物,加快了药物发现过程,特别是对于那些临床罕见疾病的治疗药物发现有着更为重要的意义。本课题主要采用生物芯片技术,运用现行公认的生物信息学方法,检测Nitrofen诱导CDH胎肺发育不良中的差异表达基因及其相关miRNA表达模式,揭示了全转录组水平的编码基因的表达变化,结合已知的基因功能和信号通路以及miRNA靶基因预测数据库,探讨非编码基因miRNA在转录后水平对编码基因转录后的潜在调控关系和作用,多角度、全方面综合地分析和归纳miRNA所调控的靶基因的功能、信号通路及相关干预化合物,这将深化CDH肺发育不良发病机制的认识,为预防肺发育不良的发生及探索新的产前干预方法提供理论依据和实验基础。研究目的(1)利用国际上通用的CDH动物模型(Nitrofen诱导CDH大鼠模型),通过全基因组mRNA表达谱芯片检测技术,研究肺发育不良mRNA表达谱变化；(2)利用miRNA芯片的检测,通过生物信息学技术分析差异表达miRNA与mRNA,研究CDH肺发育不良中miRNA和]mRNA表达调控网络及生物功能,为进一步揭示CDH肺发育不良的机制提供更直接的科学线索。(3)通过生物信息学药物筛选工具Connectivity Map,研究CDH肺发育不良中基因与化合物分子功能的关系,为开发CDH肺发育不良的干预药物提供更直接的实验依据。研究方法1. Nitrofen诱导CDH大鼠模型构建取成年SPF级SD雌性大鼠12只,将其编号后根据随机数字表法分为对照组和CDH组,另取6只雄性SD大鼠,将雄性和雌性SD大鼠按1：2比例合笼过夜,于第二日上午在显微镜下观察雌性大鼠阴道涂片,镜下见到精子者视为妊娠,当天上午则定为妊娠第0.5天。在孕第9.5天,CDH组大鼠经胃管注入Nitrofen100 mg(溶于橄榄油,浓度100mg/ml),对照组大鼠则灌入1ml橄榄油。在妊娠第21.5天,两组分别在全身麻醉下行剖宫产术取出胎鼠,解剖胎鼠胸腔后取左肺组织。2. mRNA表达谱芯片检测采取Agilent 4×44K大鼠全基因表达谱芯片检测胎肺mRNA表达谱,分析差异化的mRNA;利用文献挖掘工具FACTA及Pubmed数据库对表达差异的mRNA进行验证。3. miRNA芯片检测及差异miRNA-mRNA表达谱信息的联合分析利用miRNA芯片(Agilent Rat miRNA 8×15K)检测Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺miRNA的表达情况,通过TargetScan预测差异表达miRNA的靶基因,联合差异表达mRNA进行基因本体论(Gene Ontology)分析和信号通路(Pathway)分析,并筛选出相关的miRNA及其靶基因。4.已筛选miRNA及其靶基因的验证应用实时荧光定量PCR检测miRNA及其靶基因在Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺中的表达水平,免疫组化检测靶基因在胎肺组织中的定位,双荧光素酶报告实验明确miRNA及其靶基因的调节关系。5. mRNA表达谱信息与connectivity map药物数据库的整合分析应用生物信息学工具Connectivity Map,整合差异表达的mRNA信息,推测CDH肺发育不良中基因与药物小分子功能的关系。研究结果(1) Nitrofen诱导CDH大鼠模型对照组的6只孕鼠经剖宫产得到胎鼠71只。Nitrofen诱导CDH组6只孕鼠得到胎鼠59只,其中膈疝共38只,占64.4%(38/59)：膈疝均为左侧的后外侧巨大膈疝(膈肌缺损达50%以上),疝入胸腔的腹腔脏器主要有肝脏、胃、小肠和脾脏。解剖膈疝胎鼠胸腔后可见双肺均缩小,与对照组相比,左肺明显发育不良。HE染色从组织学上证实模型胎肺发育不良。(2) mRNA表达谱在所检测的17,679个基因中,与对照组相比,CDH组共有10,121个mRNA表达上调、7,558个mRNA表达下调。利用Pubmed数据库及文献挖掘工具FACTA进行验证,共有63个相同的检测基因,其中79.4%(50/63)与mRNA表达谱芯片检测结果一致,表明mRNA芯片的实验结果可信。(3) mRNA表达谱信息与其相应miRNA的联合分析13个表达上调的miRNA共有3,126个表达下调的靶基因,共涉及716条信号通路,其中共同的信号通路是TGFβ信号通路、GnRHR信号通路：10个表达下调的miRNA共有2,729个表达上调的靶基因,共涉及564条信号通路,其中共同的信号通路是WNT信号通路、TGFβ信号通路、FGF信号通路、GnRHR信号通路。选取TGFβ信号通路中TGF-β2基因及其相应mir-141-3p、WNT信号通路中FZD8基因及其相应mir-375-3p进行下一步的验证。(4) TGFβ信号通路中TGF-β2基因及其相应mir-141-3p在Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺中的表达CDH组与对照组胎肺中mir-141-3p的相对表达量分别为1.57±0.28、1.00±0.18,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。CDH组和对照组胎肺中TGF-β2 mRNA的相对表达量分别为0.58±0.17、1.00±0.15,两组相比差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化检测显示TGF-β2主要表达在气道上皮细胞,CDH组中TGF-β2的表达水平明显低于对照组(20.32±3.54、45.14±4.56,p<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,mir-141-3p与TGFβ-2存在直接调控关系。(5)WNT信号通路中FZD8基因及其相应mir-375-3p在Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺中的表达CDH组与对照组胎肺中mir-375-3p的相对表达量分别为0.41±0.15、1.00±0.17,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。CDH组和对照组胎肺中TGF-β2 mRNA的相对表达量分别为1.62±0.20、1.00±0.16,两组相比差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化检测显示FZD8主要表达在气道上皮细胞,CDH组中FZD8的表达水平明显低于对照组(38.32±8.54、20.14±5.76,p<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,mir-375-3p与FZD8存在直接调控关系。(6) mRNA表达谱信息与connectivity map药物数据库的整合分析通过connectivity map药物数据库分析,曲匹地尔、维甲酸、间羟异丙肾上腺素等药物的负性富集分数较高且P<0.05,提示可较好地逆转TGFβ信号通路相关基因；伊洛前列素、肾上腺酮、硫马唑等药物的富集分数较高且P<0.05,提示可较好地逆转WNT信号通路相关基因。结论(1)利用高通量基因芯片检测方法可筛选出Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺发育不良的发展演变过程中差异表达基因谱,结果表明CDH肺发育不良的发生是一个涉及多基因的复杂网络调控过程,其中TGFβ信号通路、WNT信号通路、FGF信号通路、GnRHR信号通路与其关系最为密切。(2)双荧光素酶报告系统证明mir-141-3p与TGF-β2者存在直接的调节关系；在CDH组中,mir-141-3p表达水平明显上升,TGF-β2表达水平明显下降,提示mir-141-3p及其靶基因TGF-β2参与了CDH肺发育不良的发生机制。(3)双荧光素酶报告系统证明mir-375-3p与FZD8者存在直接的调节关系；在CDH组中,mir-375-3p表达水平明显下降,FZD8表达水平明显上升,提示mir-375-3p及其靶基因Fzd8参与了CDH肺发育不良的发生机制。(4)通过connectivity map药物数据库分析,曲匹地尔、维甲酸、间羟异丙肾上腺素等药物可较好地逆转TGFβ信号通路相关基因,推测可作为干预CDH肺发育不良的候选药物；伊洛前列素、肾上腺酮、硫马唑等较好地逆转WNT信号通路相关基因,推测可作为干预CDH肺发育不良的候选药物。