拟南芥At5g52970基因的功能研究及黄心突变体yh基因的图位克隆

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光合作用是地球上绝大多数生命活动的基础,该过程是在叶绿体的类囊体上进行。由于其重要性,人们对叶绿体相关蛋白功能的研究越来越多,特别是对类囊体腔蛋白在电子传递,水的裂解,PSⅡ(Photosystem Ⅱ)的组装与修复等方面。研究表明叶绿体亲免蛋白CYP38(Cyclophilin 38)可以参与PSⅡ的组装与维持其稳定性,但其作用机制还不清楚。通过酵母双杂交技术筛选到类囊体腔蛋白At5g52970可与CYP38相互作用。由于At5g52970基因功能未知,本论文试图通过研究该基因的功能,进而探索其能否协助CYP38参与PSⅡ的组装。首先,通过一对一的酵母双杂交确认了At5g52970与CYP38的C端相互作用,烟草瞬时表达、叶绿体分层等实验确定了At5g52970定位在叶绿体类囊体腔中。At5g52970基因在根、茎、花、幼叶、老叶这些组织中均有表达,但在幼叶中相对表达量较高。其次,我们通过PCR鉴定筛选得到了At5g52970的T-DNA插入突变体,对其进行RNA和蛋白水平鉴定后,确定其为无效突变体。通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站预测到At5g52970含有磷酸酶区域,可能具有磷酸酶活性。TLP18.3(Thylakoid lumen protein 18.3)是已知位于类囊体腔中的酸性磷酸酶,我们推测At5g52970可能具有相近的功能。为了阐明其功能,分别构建了at5g52970×tlp18.3双突变体和at5g52970×cyp38-2双突变体。结果显示,在正常光条件下at5g52970、tlp18.3单突变体和at5g52970×tlp18.3双突变体与Col相比表型无明显差别,而at5g52970×cyp38-2与cyp38-2表型相似,植株均出现矮小、发育迟缓等表型,说明At5g52970功能可能体现在其它方面;同时,在变光条件下,突变体的表型与Col相比无明显差异,说明at5g52970突变体对光照变化不敏感。为了探究At5g52970基因的功能,我们将p35S::52970CDS-GFP载体转入at5g52970突变体和Col中,T1代筛选出有若干黄色植株,取其中一株过表达黄色植株编号为C5。Western Blot蛋白分析结果显示黄色植株中的At5g52970蛋白水平远高于Col。PCR检测显示黄色表型可能是由于p35S::52970CDS-GFP载体所导致。为了进行验证,将pro52970::52970g DNA和不带有GFP的p35S::52970CDS载体分别进行转化筛选,均未显示出黄色植株,Western Blot结果表明p35S::52970CDS转基因阳性植株的蛋白水平明显高于Col和p35S::52970CDS-GFP过表达黄色植株C5,说明C5的黄色表型应该是由于p35S::52970CDS-GFP载体导致的。为了进一步解析At5g52970的功能,对At5g52970进行了生理生化指标的测定。体内磷酸酶活性实验结果表明,at5g52970突变体的磷酸化程度与Col相比稍强。光合参数结果分析表明,at5g52970突变体的F’v/F’m高于Col,而NPQ(Non-photochemical quenching)低于Col,说明at5g52970突变体的光合效率略高于Col。BN-PAGE结果表明at5g52970突变体的LHCⅡ assembly比Col多,且PSI M,PSⅡ D比Col略低,说明at5g52970突变体的光合效率受到影响。与此同时,我们在筛选tlp18.3突变体过程中得到一株黄心突变体植株yh(Yellow Heart,yh)。DNA水平鉴定其仍然有tlp18.3 T-DNA的插入,将tlp18.3的T-DNA清除后,yh突变体依然为黄心表型,推测黄心表型是由新的基因突变导致。遗传学分析表明它是单基因隐性遗传。通过图位克隆技术对yh突变体进行基因定位,结果表明突变体定位于第一条染色体的INS1_55_342与INS1_56_34分子标记之间,区间大小为676 kb。通过全基因组测序,确定该突变体可能是At1g64790的等位突变体。m RNA水平鉴定结果表明突变体条带比Col小且较弱,通过测序进一步证实yh突变体碱基缺少了459 bp。虽然yh突变体与At1g64790的弱突变体ila黄心表型相似,但它们的叶边缘形状不同,表明yh突变体在叶绿体及叶片性状发育过程中有一定功能,这将为后续叶片性状的研究提供遗传材料。
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