【摘 要】
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苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）广泛侵染梨、苹果和核果类果树,可引起梨褪绿叶斑病及桃假痘病等重要病害。该病毒为乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）三基因亚科（Trivirinae）纤毛病毒属（Trichovirus）代表种,基因组含有3个部分重叠的开放阅读框,分别编码复制相关蛋白（Rep）、运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP
【基金项目】
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国家重点研发项目“园艺作物病毒检测及无病毒苗木繁育技术”（2019YFD1001800）； 国家梨产业技术体系（CARS-28-16）；
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苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）广泛侵染梨、苹果和核果类果树,可引起梨褪绿叶斑病及桃假痘病等重要病害。该病毒为乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）三基因亚科（Trivirinae）纤毛病毒属（Trichovirus）代表种,基因组含有3个部分重叠的开放阅读框,分别编码复制相关蛋白（Rep）、运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）。病毒蛋白间以及病毒与寄主因子间的互作是病毒复制及侵染寄主植物的重要环节。本研究从梨样品中扩增获得了该病毒各蛋白的编码序列（Coding sequence,CDS）,分析了病毒蛋白间互作特性,并从梨酵母双杂交cDNA文库中筛选到与该病毒CP互作的梨蛋白。主要研究结果如下:1.根据已报道的ACLSV不同分离物序列设计了引物MF/RC,从来源于福建建宁（JN）、湖北枝江（ZJ）和山东昌乐（CL）梨样品中扩增获得包含ACLSV的MP和CP基因的1635 bp片段。所获片段的核苷酸序列相似性为92.90%-100%,其中MP及CP基因序列与已报道相应序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性分别为65.3%-100%和 57.4%-100%及 68.4%-100%和 72.0%-100%。所有获得的序列在系统进化树中均聚集在同一个分支。2.从来源于福建建宁的梨样品JN1中扩增获得ACLSV编码ORF1的Met、Hel、Pep和RdRp CDS。将这些片段和来自样品JN1、ZJ4和CL1的MP和CP及该病毒BD分离物的CP分别构建至载体pGBKT7和pGADT7,酵母双杂交（Y2H）分析结果显示,来自JN1的组合RdRp/MP、Pep/CP及MP/CP存在互作,本实验室前期已构建的DY-MP可自身互作。来自不同分离物相互作用的蛋白组合有JN1-Pep/ZJ4-CP、JN1-Pep/CL1-CP、DY-MP/JN1-RdRp、DY-MP/JN1-MP、DY-MP/JN1-CP、DY-MP/ZJ4-MP、DY-MP/CL1-MP、JN1-MP/ZJ4-CP、JN1-MP/CL1-CP 和 ZJ4-MP/JN1-RdRp。进一步采用双分子荧光互补（BiFC）实验确认这些组合存在互作,其中JN1-Pep与JN1-CP、ZJ4-CP和CL1-CP的互作信号在细胞核,其他组合互作信号均在胞间连丝。3.以BD分离物编码的CP为诱饵,采用酵母双杂交方法从红香酥梨cDNA文库中筛选到与CP互作的33个候选梨蛋白,这些蛋白主要参与植物的应激反应和光合作用。克隆了 10个候选梨蛋白的编码基因,Y2H和BiFC分析结果显示,E3泛素连接酶家族蛋白 MIEL（E3 ubiquitin-protein ligase MIEL1）和 BOI（probable BOI-related E3 ubiquitin-protein ligase2）可与 CP 互作。MIEL 与 CP 在细胞核和细胞膜上互作,与这两种蛋白的亚细胞定位一致;BOI与CP在细胞核中互作。Y2H分析明确MIEL的1-99 aa是与CP互作所必需的,BOI与CP的互作需要全长,CP需完整序列才能与MIEL和BOI互作。
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