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研究目的:
本研究通过向SGC-7901细胞中加入可溶性纤维连接蛋白(fibronectin,FN)以及蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活剂等探讨可溶性纤维连接蛋白对PKA活性的影响并初步分析其机制,并进一步研究可溶性FN对PKA相关的功能的影响。
研究内容:
(1)实验采用蛋白印迹技术检测SGC-7901细胞中可溶性FN在不同浓度及作用时间情况下对PKA Cα亚基表达水平以及PKA作用底物血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)磷酸化水平的影响；
(2)检测FN能否抑制由不同PKA激活剂活化的PKA,初步确定FN在cAMP／PKA信号通路中的作用位点；
(3)采用免疫荧光技术检测可溶性FN对PKA作用底物p-VASP分布的影响；
(4)wtHt31质粒和GFP质粒共转染入SGC-7901细胞,建立了能够稳定表达人甲状腺A激酶锚定蛋白(human thyroid AKAP,Ht31)肽段的SGC细胞,探讨破坏PKA锚定后FN对PKA活性的影响是否发生变化;
(5)采用鬼笔环肽染色法检测FN对正常SGC-7901细胞以及转染Ht31肽段的SGC细胞中的细胞骨架的影响；
(6)利用细胞刮除-损伤实验在倒置显微镜下观察细胞迁移情况,检测不同实验条件下SGC-7901细胞迁移行为的变化。
实验结果:
(1)在SGC-7901细胞中,选取1μg／ml可溶性FN作用12 h以后,可溶性FN对PKA活性存在时间依赖性抑制效应；可溶性FN在0.5-8μg／ml浓度区间内作用24 h以后,对PKA活性存在剂量依赖性抑制效应；
(2)可溶性FN可以抑制Forskolin引起的PKA活化,不能抑制外源性CPT-cAMP引起的PKA活化；
(3)Ht31破坏PKA锚定后,FN对PKA活性的抑制作用消失；
(4)免疫荧光显示可溶性FN可以使VASP磷酸化位置聚集于细胞边缘；
(5)Forskolin抑制可溶性FN在正常SGC-7901细胞边缘处使应激纤维聚集的作用,转染wtHt31肽段的SGC细胞这种抑制作用被取消；
(6)可溶性FN能够拮抗PKA活化导致的细胞迁移抑制,这一作用受PKA锚定影响。
结论:
综合以上实验结果,我们认为在SGC-7901细胞中可溶性FN对PKA活性存在抑制作用,这种抑制效应在一定剂量、时间条件下与可溶性FN的浓度及作用时间呈正比且取决于PKA能否正常锚定；FN抑制PKA活化的作用位点在PKA的上游,可能是腺苷酸环化酶；FN可能通过影响PKA磷酸化底物影响细胞骨架的改变,进而拮抗PKA活化对肿瘤细胞迁移的抑制作用。