【摘 要】
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白细胞介素21(interleukin,IL-21)是一种具有四螺旋束的Ⅰ型细胞因子,它主要由CD4+T细胞以及天然杀伤T细胞(NKT)分泌,在先天性和适应性免疫应答中具有多效调节作用。蛋白质的
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白细胞介素21(interleukin,IL-21)是一种具有四螺旋束的Ⅰ型细胞因子,它主要由CD4+T细胞以及天然杀伤T细胞(NKT)分泌,在先天性和适应性免疫应答中具有多效调节作用。蛋白质的生物功能取决于其空间结构,IL-21在不同物种中发挥相似的生物功能是由其特殊的结构所决定。因此,对白细胞介素21结构进化的研究有助于阐释其在免疫调节机制中的独特作用。本课题在已有人IL-21(hIL-21)结构的基础上,以鼠的IL-21(mIL-21)为突破口,实验论证IL-21结构的保守性。1、蛋白质mIL-21的表达、纯化及复性重组蛋白mIL-21在原核体系大肠杆菌中表达时,主要以包涵体的形式存在。因此在其复性过程中,采用两步稀释透析复性方法,即先两次稀释降低蛋白浓度,再透析一次就可完成复性过程。此方法不仅极大程度地缩短了透析的时间,而且还显著提升了透析效率。此外还考虑到mIL-21的特殊性,易降解,便在其复性液里加入适当的EDTA以及丙三醇。此方法确实对蛋白质正确恢复其三维结构起到一定的作用。同时也考虑到只依赖Ni-NTA纯化并不能得到纯净的蛋白,便选用FPLC再次纯化,纯化效果显著提升。这些条件的优化对后续核磁共振所需的(15)~N、(13)~C双标蛋白质奠定了基础。2、核磁共振方法解析溶液蛋白质的三维结构运用液体高分辨核磁共振技术采集一系列谱图包括:2D1~H-(15)~N HSQC、3D(15)~N编辑的 NOESY-HSQC,(15)~N/(13)~C 双标记的 3D HNCA、3D HN(CO)CA、3D NHCACB、3D NH(CO)CACB、3D H(CCCO)NH、3D(H)CCH-TOCSY、3D(13)~C 编辑的NOESY-HSQC等。对其进行主链、侧链残基各原子化学位移的归属以及NOE谱图的解析,并将这些信息写成二面角约束、距离约束和氢键约束条件。通过CYANA软件反复多轮计算,对所得到的最优结构再进一步的优化,直至最终得到拥有满意评估参数的结构。
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