研究目的大肠癌是结肠癌和直肠癌的总称,是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。近年来,建立在分子生物学基础上的靶向治疗,已经取得了实质性的疗效,以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的单克隆抗体治疗晚期大肠癌为标志,预示着大肠癌进入了分子靶向治疗的新纪元。作为抗EGFR单抗的靶点,EGFR目前受到高度的关注。研究表明Annexin A1(简称ANXA1)起到抑癌基因作用,其可以调节EGFR的内吞及降解,促进凋亡,抑制肿瘤形成。本研究通过检测大肠癌组织中ANXA1在K-ras、BRAF基因野生型及K-ras、BRAF基因突变型大肠癌组织的转录及表达水平,及相应癌旁正常粘膜组织ANXA1的表达情况,分析不同组织中ANXA1的转录和表达的异同,旨在探讨ANXA1与大肠癌的临床、病理及分子生物学特征的关系,分析ANXA1表达情况与K-ras及BRAF基因突变的相关性,为大肠癌的诊断、治疗及预后判断提供客观的参考指标。同时,探讨ANXA1的表达水平是否可以替代K-ras基因突变检测,作为分子靶向药物应用于大肠癌临床治疗的参考指标。研究方法1、收集大肠癌及相应癌旁正常粘膜组织,部分液氮保存,部分石蜡包埋。同时收集样本临床病理资料。2、抽提基因组DNA,通过基因测序方法检测大肠癌的基因突变情况。3、应用免疫组织化学、Real-time PCR及Western blot蛋白印迹等方法检测ANXA1在K-ras、BRAF基因野生型及K-ras、BRAF基因突变型大肠癌组织及对应正常粘膜组织的转录及表达水平,分析不同组中ANXA1的转录和表达水平的异同。结果1、在20例大肠癌标本中,检测出K-ras基因突变6例,突变率为30%,正常粘膜均未检测出K-ras基因突变。然而在20例标本及正常粘膜中均未检测出BRAF突变。2、在K-ras基因野生型组,大肠癌组织中ANXA1 mRNA的转录水平较癌旁正常组织显著下降,是癌旁正常组织的0.122±0.057倍,其差异具有统计学意义(单样本t检验,t=10.61,P<0.001),大肠癌组织中ANXA1蛋白的表达水平较癌旁正常组织显著下降,是癌旁正常组织的0.729±0.034倍,其差异具有统计学意义(单样本t检验,t=5.953,P<0.001)；在K-ras基因突变型组,大肠癌组织中ANXA1 mRNA的表达水平显著高于自身对照的癌旁正常组织,是癌旁正常组织的168.60±46.67倍,其差异具有统计学意义(单样本t检验,t=5.865,P<0.01),大肠癌组织中ANXA1蛋白的表达水平显著高于自身对照的癌旁正常组织,是癌旁正常组织的1.854±0.216倍,其差异具有统计学意义(单样本t检验,t=3.790,P<0.05)。因此,在K-ras基因野生型大肠癌组织中ANXA1表达下调；而在K-ras基因突变型大肠癌组织中ANXA1表达上调；与K-ras基因野生型标本相比,ANXA1在K-ras基因突变型标本中无论在转录水平还是在蛋白表达水平都显著增加。3、大肠癌伴有K-ras基因突变者肿瘤的浸润深度较深,病理学分型较差,且出现淋巴结转移及远端转移的比例较高；在ANXA1表达上调的样本中肿瘤发生淋巴结转移及远端转移的比例明显高于ANXA1表达下调的样本(P>0.05)。且在ANXA1表达上调的样本中K-ras基因的突变率明显高于ANXA1表达下调的样本(P<0.001)。结论1、本研究首次阐述了ANXA1在大肠癌中的表达与K-ras基因突变的关系。数据显示在K-ras基因野生型大肠癌样本中,ANXA1表达下调；而在K-ras基因突变型大肠癌样本中,ANXA1表达显著上调。ANXA1的表达水平可能成为潜在的预测大肠癌基因型,替代K-ras基因突变检测,实现临床筛查,指导临床应用分子靶向药物的参考指标,具有广泛的临床应用价值。2、研究中发现在ANXA1表达上调的样本中肿瘤发生淋巴结转移及远端转移的比例高于ANXA1表达下调的样本(P>0.05),且在ANXA1表达上调的样本中K-ras基因的突变率明显高于ANXA1表达下调的样本(P<0.001),提示在大肠癌中ANXA1表达上调可能与肿瘤的转移有关,ANXA1表达情况是否可能成为预测肿瘤预后的指标还需进一步论证。3、ANXA1对EGFR及下游Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK细胞信号通路的调控作用是通过调节EGFR的内吞及降解实现的。并且ERK/MAPK对EGFR具有负反馈作用,ERK/MAPK通过负反馈作用下调EGFR,而这种下调可能是通过上调ANXA1,加速EGFR的内吞及降解而实现的。当K-ras基因突变时,Raf/MEK/ERK/MAPK细胞信号通路的激活将不依赖EGFR的活化,因此ANXA1的上调及EGFR的下调将失去调节作用,无法抑制该通路的激活。对于ERK/MAPK对ANXA1是否有正反馈作用,还需要进一步研究。