脊椎动物的心脏是最早发育并发挥重要功能的器官之一,它的发育过程受到多种基因的共同调控,而心脏疾病的发生与这些基因的表达异常密切相关。已知TGFβ信号通路在心脏发育过程中发挥着重要的作用。本实验室的前期研究表明,斑马鱼HPRG1基因在心脏早期形态建成过程中起着重要的作用,该蛋白可能通过TGFβ信号途径调控心脏的发育过程,但其怎样通过该信号进行调控的机制尚不清楚。研究表明,一个基因的启动子区域位于该基因的起始ATG前3kb范围内(有个别基因例外)。本文假设斑马鱼HPRG1蛋白可能与TGFβ信号成员启动子之间具有相互作用。因此,本文拟从以下几个方面探讨HPRG1蛋白与TGFβ信号成员之间的相互作用关系,为后续该基因的深入功能研究探索方向。(1)利用染色质免疫沉淀(CHIP)技术分析HPRG1蛋白与TGFβ家族成员的启动子的相互作用:为了研究HPRG1蛋白是否与TGFβ家族成员的启动子存在相互作用,本文首先利用染色质免疫沉淀(CHIP)技术分析分析HPRG1蛋白是否结合在TGFβ家族成员的启动子。我们收集24小时斑马鱼胚胎约200颗,提取染色质,利用染色质免疫沉淀技术,分析HPRG1蛋白与TGFβ信号家族成员TGFβ1a、TGFβ2、TGFβ3,TGFβr1a、TGFβr2、TGFβr3、Smad1、Smad2、Smad3a、Smad4、Smad5、Smad6a、bmp2b和bmp4基因的启动子相互作用的情况,以及分析HPRG1蛋白与调控心脏发育的转录因子nkx2.5、GATA4和ISL1基因的启动子的相互作用。初步结果表明,HPRG1蛋白可以结合到上述所有基因的启动子上。(2)利用MEME网站分析各基因的3Kb启动子上的保守结合域:上述染色质免疫沉淀(CHIP)技术分析结果表明,HPRG1蛋白能结合在TGFβ信号家族每一成员的3Kb启动子上,提示这些成员的启动子上存在HPRG1蛋白的保守结合域(motif)。为了证明这一假设,本文利用MEME网站初步分析了各基因的3Kb启动子上的共同保守结合域,发现HPRG1蛋白在TGFβ信号家族的每一成员的3Kb启动子上存在3个共同的保守结合域,提示HPRG1蛋白可能能够结合在TGFβ信号家族每一成员的保守结合域上,但其真实的保守结合域有待进一步研究。(3)利用启动子荧光报告系统分析HPRG1蛋白对TGFβ家族成员的启动子的影响:为了初步证明HPRG1蛋白是结合在TGFβ家族成员的启动子上,第一步是检测HPRG1蛋白是否影响TGFβ家族成员启动子的转录表达。本文首先构建了HPRG1过表达载体pcmv-myc-HPRG1,以及荧光报告质粒PGL3-TGFβ1a、PGL3-TGFβr1a-1、PGL3-TGFβr1a-2、PGL3-TGFβr2、PGL3-Smad1、PGL3-Smad2、PGL3-Smad3a、PGL3-Smad6a、PGL3-bmp4和PGL3-GATA4。然后通过脂质体转染,将上述荧光报告质粒分别与pcmv-myc-HPRG1成组共转入HEK293T细胞中,各组质粒转染48h之后,收集细胞,用细胞裂解液裂解后,进行单荧光素酶报告分析。分析结果表明,HPRG1蛋白能够抑制TGFβ1a、TGFβr2、Smad3a、GATA4、bmp4和TGFβr1a-2启动子的活性,但激活TGFβr1a-1的活性,进一步分析TGFβr1a-1不同区段启动子的活性发现,HPRG1蛋白对TGFβr1a基因启动子的活性影响既存在激活也存在抑制作用,即在ATG上游1000-3000bp表现为激活作用,而在ATG上游0-1000bp表现为抑制作用。HPRG1蛋白对其余基因启动子的表达影响正在进行中。总之,以上实验表明,HPRG1蛋白与所有已分析的TGFβ信号家族成员之间均存在相互作用,HPRG1蛋白可能通过保守的结构域结合在TGFβ信号家族成员启动子上,从而调控TGFβ家族成员的转录表达。