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第一部分大鼠肝移植模型的建立目的:建立稳定的大鼠肝移植模型,为研究米诺环素对大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤的保护作用提供实验模型。方法:采用Kamada“二袖套法”对SD大鼠实施原位肝移植术,观察大鼠术后生存情况及并发症的发生情况。结果:三阶段总共完成大鼠原位肝移植165例。第一阶段手术成功率55%(33/60),第二阶段手术成功率91.7%(55/60),第三阶段手术成功率100%(45/45),第二阶段一周存活率85%(51/60),成功地建立了比较稳定的大鼠肝移植模型。结论:大鼠原位肝移植是一项高难度的手术操作,对术者有非常高的要求,持续大量有效的训练、娴熟稳定的显微外科技巧、精细耐心的手术操作缺一不可。只有在训练中不断总结、注重细节,不断改进、完善才能建立稳定的大鼠肝移植模型。第二部分米诺环素在大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤中的保护作用目的:(1)探讨大鼠肝移植过程中不同冷缺血保存时间对移植物MMP-9的表达及活性的影响及其参与再灌注损伤的机制。(2)探讨米诺环素对大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤的保护作用及可能的机制。方法:(1)根据供肝冷缺血保存时间,实验分为30min组、3h组及6h组。术后24h获取移植肝及血液标本。检测各组肝脏损伤指标(ALT、AST)、MPO活性及MDA含量;组织病理学改变情况;采用明胶酶谱、免疫组化检测各组移植物中MMP-9酶活性、组织定位与表达量;采用Real time-PCR检测各组移植物内MMP-9、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)、Bcl-2的表达。(2)实验分为米诺环素处理组即M组、生理盐水处理组即C组,于肝移植术后24h、48h及72h获取移植肝及血液标本。Western Blot检测移植物中Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达;其他指标的检测方法同方法(1)。结果:(1)MMP-9的表达水平及活性在6h组最高,与30min组及3h组相比差异有统计学意义(p<0.05),且随着冷缺血保存时间的延长表达量及酶的活性逐渐增加。30min组MMP-9的表达主要集中于内皮细胞及附近少量肝细胞内,肝脏组织形态无明显改变,随着冷缺血时间的延长MMP-9的表达范围逐渐向肝实质扩展且表达量逐渐增加,肝脏损伤也逐渐加重。MMP-9的表达水平及酶的活性增加与冷缺血保存致肝脏损伤程度存在着正相关,表现为肝脏损伤指标(ALT、AST)明显升高(P<0.05),肝移植物中MPO的活性及MDA的含量(P<0.05)、促炎因子(IL-1β、IFN-γ)表达都明显增加(p<0.05),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(p<0.05),差异均有统计学意义。(2)与C组相比较,M组移植后各个时间点MMP-9的表达水平及酶的活性明显降低,差异有统计学意义(p<0.05),且肝功(ALT、AST)(p<0.05)、移植物内MPO活性及MDA含量(p<0.05)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)(p<0.05)的表达都明显降低,Bcl-2的表达明显升高(p<0.05),免疫组化MMP-9的表达范围缩小、表达量降低,病理学损伤也明显减轻。M-1组与C-1组相比较Caspase 3蛋白表达明显降低(p<0.05),而Bcl-2的蛋白表达明显升高(p<0.05)。结论:⑴.MMP-9在冷缺血再灌注损伤过程中扮演着重要的角色,随着冷缺血保存时间的延长,MMP-9表达水平及活性明显增加。⑵.MMP-9可以通过降解内皮细胞基底膜及肝细胞外基质,促进中性粒细胞的迁移、浸润及炎症介质TNF-α、IL-1β的释放,同时也可以抑制Bcl-2表达促进肝细胞凋亡,从而加重肝脏缺血再灌注损伤。⑶.米诺环素能够显著抑制MMP-9的表达水平及活性,减少中性粒细胞的迁移浸润及降低其炎症介质的释放以及肝细胞的凋亡,因此能明显缓解大鼠肝移植术后冷缺血再灌注损伤。