第一部分MCD+HF诱导S-D大鼠脂肪肝模型的研究[目的]科学家们长期致力于建立的脂肪肝动物模型,以期能够更加准确的模拟NAFLD的发病机理和进展过程,以此来探索新的治疗策略。然而,到目前为止,尚没有一种模型能够完全准确地模拟出NAFLD全部特点。在营养型脂肪肝模型中最常用的饲料是蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline deficiency,MCD)饲料喂养的模型和高脂肪(high fat,HF)喂养模型。前者主要缺陷是动物不仅不会出现体重增加,反而表现为体重严重下降,后者存在诱导结果不稳定性。因此,本实验拟采用混合型营养性(MCD+HF)大鼠模型建立不同程度脂肪肝模型,确定其稳定性和适用性,以适用于本实验下一步研究。[方法]用正常大鼠饲料和MCD+HF复合型饲料2种不同饲料喂食Sprague-Dawley(S-D)大鼠诱导肝脏脂肪变性,分别为正常对照组和NAFLD组。S-D大鼠用正常饲料喂养直至体重达到250-320g,然后进入实验,每组6只大鼠,分别用正常饲料和MCD+HF分别1,2,4,6周和3个月。每天记录下大鼠体重。在喂养终点,大鼠被麻醉后开腹后,收集肝脏标本用于分子生物学检测,并收集血液做生化分析。肝脏脂肪变性从三个方面来评估:(1)肝脏脂肪变性程度:大体肉眼描述性定性评估,肝脏-体重比,组织学对肝脏中脂肪蓄积分布的评估;(2)肝脏损伤程度,用组织学标准定性评估肝脏损伤,测量肝酶水平来定量分析肝脏损伤情况;(3)肝脏代谢功能:通过评估LPO和肝脏GSH来评价肝脏代谢障碍,定量分析LPO和肝总GSH是反映氧应激和抗氧化能力的指标。[结果]所有进入实验动物均存活。NAFLD组中使用MCD+HF饲养没有影响到大鼠的正常生长和寿命。3个月喂养后,两组大鼠的体重增加到400-450g,体重增加明显,结果两组数据无差异。1-2周后,NAFLD组的肝脏与对照组相比出现增大,脂肪增多,肝脏表面变黄。肝脏边缘变圆钝,肝脏质地开始出现轻度柔软感。大约在4-6周时,肉眼观表现更加明显,之后出现轻度的好转。NAFLD组绝对肝切除量在第4,6周和3个月时,明显重于对照组(13.80±1.79 vs 8.76±0.92,14.20±1.15vs 8.75±0.91,12.56±1.03 vs 8.78±0.82,p<0.05,单位g)。而各时间段的肝-体重比,NAFLD组均明显高于对照组(4.05±0.35 vs 3.22±0.21,4.51±0.27 vs 3.22±0.22,5.42±0.74 vs 3.23±0.21,5.52±0.26 vs 3.22±0.20,4.48±0.30 vs 3.24±0.19,p<0.05,单位g)。在NAFLD组,第1周喂养时,肝细胞出现轻度到中度小泡型脂肪变和轻度的大泡型脂肪变,其程度越15%左右,为轻度肝脂肪变性。小泡型脂肪变主要出现在中央周围区(1区)和3区,而混合型脂肪变主要出现在2区。喂养2周后,肝脏出现中等混合型空泡脂肪变,脂肪变性程度约32%,呈中度肝脂肪变性。大泡型脂肪变主要分布在1和2区,小泡型脂肪变主要分布在3区,混合型空泡脂肪变主要分布在1和2区。在4周末,肝脏出现严重混合型脂肪变,脂肪变性程度约占63%,为重度肝脂肪变性。大泡型脂肪变主要分布在1和2区,而小泡型分布在3区。在第6周末,肝脏脂肪变类型与分布与4周时观察基本一致。但是脂肪变严重程度有所减轻。在3个月末,以重度肝脂肪变性为表现,主要是以1区和2区大泡型空泡变,和3区混合型空泡样变性。NAFLD组大鼠出现轻度的肝损害表现,主要是肝酶的释放。在喂养1-2周时开始出现转氨酶的升高,4周时达到最高值,主要是以AST升高明显。ALT在所有观察点均数没有超过100IU/L,在第6周时比对照组有明显增高(89.50±29.83 vs 42.50±5.51,p<0.05,单位IU/L)。NAFLD组释放AST水平在第4,6周和第3月时明显高于对照组(210.17±95.28 vs92.03±23.70,199.67±54.06 vs 90.03±21.70,140.01±22.73 vs 90.03±21.70,p<0.05,单位IU/L)并且与随肝脂肪变性严重程度改变而改变。NAFLD组大鼠肝脏组织发现了LPO的升高(68.7±14.0 vs 53.2±2.8,120.6±18.3 v 53.1±2.7,150.3±43.0 vs53.3±2.5,168.7±44.5 vs 52.8±3.0,148.1±26.7 vs 53.3±2.7,p<0.05,单位μg/g)。NAFLD组诱导出GSH的下降,从第一周饲养开始,GSH值就开始下降到,在3个月末期,GSH有轻度上升(2476.4±67.7 vs 3698.3±122.8,2371.8±127.3 vs3720.2±117.5,2237.9±118.1 vs 3710.7±102.8,2399.1±60.8 vs 3701.4±98.8,2426.6±113.5 vs 3710.2±103.4,p<0.05,单位μg/g)。[结论]MCD+HF饲料能诱导S-D大鼠肝脂肪变性。在整个饲养过程中,无一死亡动物,具有良好的动物耐受性。MCD+HF该种饲养方法能诱导出S-D大鼠轻、中、重度脂肪肝模型,并且方法可靠,稳定。该模型符合有关脂肪肝对缺血再灌注损伤相关研究的要求,根据研究需要选择MCD+HF饲养2~4周的大鼠。第二部分锂盐对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[目的]已经被广泛应用于治疗精神疾病精神类药物--锂盐,被证实在很多器官缺血再灌注损伤具有保护作用。本部分研究为解决锂盐在正常肝脏IRI中的作用机制如何,以为下一部分脂肪肝IRI研究打下基础。[方法]S-D大鼠用正常饲料喂养直至标准体重,然后进入实验。在喂养期的最后3天,实验组给于锂剂,对照组给于生理盐水,锂盐组在IRI后2天内每天再次给药。之后给予手术加以60min选择性热缺血处理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分别处死。切取左外叶和右叶作为组织学分析。收集右中叶和血清做分子生物学分析。本实验切片复水后用ASDCL染色来研究肝再灌注后中性粒细胞浸润。随机选取10个高倍视野(HPF,400×)采用手动计数ASDCL阳性中性粒细胞。HMGB1免疫组化和ELISA法了解HMGB1在肝IRI是否存在移位现象以及血清中HMGB1含量。蛋白免疫印迹检测再灌注后不同时间点的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,p38,p-p38,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表达变化。分析锂盐是否影响炎症反应,自噬水平以及GSK3β和MAPK信号途径。[结果]本实验检测锂盐组再灌注后的0.5h,6h,24h,48h组与生理盐水组的肝酶学变化。经过60分钟热缺血处理后,血清ALT水平在再灌注后0.5h出现升高,6h后达到高峰,之后开始下降。而锂盐处理组在再灌注后对应时间点出现明显下降(ALT释放水平分别为596±171 vs 392±126,823±155 vs 604±119,221±34 vs147±34,73±5 vs 62±9,各组p<0.05,单位IU/L;AST释放水平为574±140 vs371±101,892±160 vs 594±127,426±35 vs 363±45,110±20 vs 98±11,各组p<0.05,单位IU/L)。ASDCL染色阳性细胞结果显示锂盐处理组中性粒细胞浸润明显要低于生理盐水组大鼠,锂盐处理组:9±1/HPF;生理盐水组:14±4/HPF,p<0.05。肝脏IR后,HMGB1表达上调,并且从细胞核外移到细胞浆中。本实验采用ELISA方法检测肝缺血再灌注后HMGB1表达,在生理盐水组合锂盐处理组中均有HMGB1表达升高,而锂盐处理组的HMGB1明显低于生理盐水组,在0.5h组内生理盐水组HMGB1高于锂盐组约3倍。本实验通过60分钟热缺血再灌注后不同时间点了解缺血再灌注有GSK3β磷酸化水平。与正常未处理组比较,再灌注后0.5h磷酸化的GSK3β/Ser9水平快速下降,并保持去磷酸化状态。而锂盐处理组的磷酸化GSK3β/Ser9水平高于生理盐水组大鼠。锂盐处理组并不影响细胞内总GSK3β水平。本实验为了解锂盐是否能影响肝缺血再灌注后MAPK激活,检测了ERK,JNK与p38的磷酸化水平。结果显示在生理盐水组再灌注后0.5h,ERK,JNK和p38磷酸化增加。而锂盐处理组在再灌注后0.5h,ERK磷酸化水平高于生理盐水组。JNK和p38磷酸化水平是下降的。锂盐处理组并没有影响到整个细胞水平的ERK,JNK和p38表达。本实验通过研究凋亡蛋白caspase-3表达了解锂盐在缺血再灌注损伤中对凋亡的影响。相对于生理盐水组,锂盐处理组的大鼠热缺血再灌注后caspase-3分裂在0.5h,6h时被抑制。本实验为证明锂盐是否能诱导肝脏IRI肝细胞自噬,检测自噬蛋白LC3和p62在锂盐处理组和生理盐水处理组表达水平。在热缺血60分钟后,LC3-II表达在整个再灌注过程中升高,在锂盐处理组中LC3-II表达明显升高。而p62表达在再灌注后各个时间段均有明显下降,且锂盐处理组要低于生理盐水组。[结论]锂盐具有保护肝IRI的作用。锂盐保护肝IRI作用机制可能包括抑制炎症反应,抑制GSK3β活性,调控MAPK活性,抑制肝细胞凋亡,以及诱导肝细胞自噬。第三部分锂盐对大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[目的]本实验通过建立脂肪肝动物模型来研究锂盐在肝脏缺血再灌注损伤中作用及其分子机制,为临床降低NAFLD患者行肝脏手术损伤提供理论基础。[方法]标准体重S-D大鼠用MCD+HF饲料喂养2周,建立中度脂肪肝模型。在行手术前3天,实验组给于锂剂,对照组给于生理盐水。之后给予手术加以60min选择性热缺血处理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分别处死。切取左外叶和右上叶做组织学分析,收集右中叶和血清做分子生物学分析。本实验用水化切片ASDCL染色来研究肝再灌注后中性粒细胞浸润。随机选取10个高倍视野(HPF,400×)采用手动计数ASDCL阳性中性粒细胞。HMGB1免疫组化了解HMGB1在肝IRI是否存在移位现象,用ELISA方法检测血清HMGB1含量。蛋白免疫印迹检测再灌注后不同时间点的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表达变化。分析锂盐是否影响脂肪肝IRI的炎症反应,自噬水平以及GSK3β和MAPK信号途径。[结果]S-D大鼠用MCD+HF喂养2周后表现为中度肝脏脂肪变性。本实验通过检测锂盐组再灌注后的0.5h,6h,24h,48h组与生理盐水组的肝酶学变化,证明锂盐有降低脂肪肝脏ALT,AST释放水平作用。经过60分钟热缺血处理后,血清ALT和AST显著升高。二者均再灌注后0.5h血清ALT升高,6h后达到峰值,之后下降。锂盐明显减轻IRI肝损伤作用,表现为血清中ALT和AST水平相对更低(ALT释放水平402±120 vs 616±171,p<0.05;450±102 vs 860±134,p<0.05;310±52 vs 402±44,p<0.05;198±34 vs 210±35,p>0.05;AST释放水平391±127 vs598±139,p<0.05;657±178 vs 1123±234,p<0.05;610±56 vs 178±18,p<0.05;788±98 vs 245±36,p<0.05;单位:IU/L)。S-D大鼠喂养MCD+HF饲料2W后检查肝脏自噬蛋白表达。自噬蛋白LC3-II的表达在脂肪肝细胞中显著降低,而自噬蛋白p62的表达在脂肪肝细胞中显著增加。而经过60分钟热缺血脂肪肝大鼠LC3-II表达水平,在各个时间段显示锂盐处理组表达水平明显升高,且与生理盐水组比较有明显升高,同时锂盐组相对于生理盐水组显著降低了p62的蛋白表达水平。本实验发现,在再灌注后0.5h GSK3β/Ser9磷酸化水平迅速升高,随着6h后轻度降低后再次升高,在24小时后达到峰值。与生理盐水组水平相比,锂盐预处理组的GSK3β/Ser9磷酸化水平更高一些,而细胞总GSK3β水平没有受到锂盐影响。而再灌注后0.5h生理盐水组中脂肪肝细胞核内HMGB1染色明显减少,免疫组化结果显示HMGB1阴性核率:锂盐处理组3.42±1.04%,而生理盐水组为6.18±1.21%,p<0.01。本实验采用ELISA方法检测肝缺血再灌注后HMGB1表达,在生理盐水组合锂盐处理组中均有HMGB1表达升高,而0.5h,6h组锂盐处理组的HMGB1显著低于生理盐水组。本实验通过检测ASDCL印迹阳性中性粒细胞浸润在热缺血60min再灌注24小时后脂肪肝大鼠肝脏中表现。结果显示生理盐水组中性粒细胞浸润明显高于锂盐预处理组,ASDCL核阳性治疗组为8±6/HPF,而对照组21±5/HPF,p<0.001。经过60分钟热缺血后生理盐水组的JNK和ERK磷酸化在再灌注后0.5h后增加了。而锂盐预处理组大鼠在热I/R后出现JNK活性降低了。此外,ERK磷酸化锂盐预处理组明显高于生理盐水组。然而,细胞内总JNK和ERK水平并没有受到锂盐的影响。在本实验中通过western blotting发现锂盐预处理组抑制IRI诱导caspase-3分裂。[结论]锂盐预处理的脂肪肝能改善肝IRI,锂盐保护脂肪肝IRI作用机制有抑制炎症反应,抑制GSK3β活性,调控MAPK活性,抑制肝细胞凋亡,以及诱导肝细胞自噬。锂盐是一种简单、合适的方法减轻脂肪肝IRI,在肝移植中扩大供体的来源,降低术后并发症和死亡率的研究中是一种有前景的药物。