由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病,它能进一步发展为肝硬化、肝细胞癌(HCC)而导致死亡。据统计,全世界大约有3.5亿乙肝感染者,其中每年大约有120万患者由于急性或慢性乙肝感染而死亡。2006年全国乙型肝炎流行病学调查显示,我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%,幼龄感染者中90%可以发展为慢性肝炎,其中又有40%可以发展为肝硬化,而成人感染者中只有5%转为慢性乙肝,其中有5-20%会发展为肝硬化。干扰素α与核苷类似物,如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等是HBV感染的主要治疗药物。由于干扰素疗法具有疗程较短(48周),复发率较低,抗原转换率较好的特点,在治疗慢性乙肝方面具有独特的优势。近年来,聚乙二醇化干扰素(又称长效干扰素,主要有PEG-IFNa2a,PEG-IFNα2b两种)由于体内半衰期达一周,在慢乙肝患者中获得了更高的e抗原血清转换和表面抗原血清转换(2.9%,PEG-IFNa2a)。然而,长效干扰素目前获得的e抗原血清转换率(PEG-IFNa2a32%, PEG-IFNa2b36%)、病毒核酸清除率仍远未令人满意,此外治疗容易引发如流感样症状、抑郁、性格改变等副作用,严重影响病人生活质量。因此,国内外研究者一直在探索如何在治疗前预测干扰素疗效,如Buster等通过分析病人治疗前临床参数(如ALT, HBVDNA,基因型等)与疗效的关系,制定了一个疗效预测指数,然而其预测灵敏度与特异性仍远未令人满意。小非编码RNA(约22个核苷酸),又称小RNA (microRNA, miRNA)是一类存在于各种组织中,广泛参与多种生理与病理过程的小分子RNA。miRNAs通过与靶mRNA3’非翻译末端核苷酸配对促进其降解或抑制翻译,参与了包括细胞发育、造血、凋亡和细胞增殖等几乎所有生命活动。已有研究发现miRNA在血液中能以游离状态存在,并可作为肝脏损伤和肿瘤疾病非常敏感的分子标记。为了探索慢性乙肝患者血浆miRNA表达谱与干扰素疗效的关系,本研究对94例接受普通与长效干扰素治疗的慢乙肝患者治疗前血浆抽提miRNA,进行基因芯片检测,其中66例归入训练集,28例归入测试集。根据miRNA与干扰素初期病毒学应答(early virological response, EVR)的相关性,通过OneR特征值排名方法获得最有预测意义的特征miRNA,通过支持向量机(Support Vector Machine, SVM)算法产生预测模型。为了获得最高的准确率,通过IFS曲线(incremental feature selection)与去一法(leave-one-out)交叉验证方法优化纳入模型的特征miRNA数量。结果显示,由11个miRNA(let-7a,miR-30a,miR-1290,miR-106b,miR-1224-5p,miR-939,miR-1281,miR-198,let-7f,miR-22和miR-638)组成的特征谱在训练集中获得74.2%的总体准确率,并在测试集中获得验证(准确率71.4%)。单因素与多因素logistic回归分析比较miRNA预测谱与相关临床参数与疗效的相关性显示：miRNA谱是与疗效相关的独立因素(单因素回归分析OR=7.35,p=2.12E-05,多因素回归分析OR=6.62,p=2.00E-05),而ALT水平只有较低的相关性(单因素回归分析OR=1.47,p=0.002,多因素回归分析OR=1.37,p=0.029)。将miRNA谱与ALT水平结合纳入logistic回归模型,总体预测准确率可由73.4%提高到77.3%。为了评价血浆中miRNA水平与肝脏miRNA谱的关系,本研究进一步对94例病例中13份肝组织FFPE (formalin fixed paraffin embedded,福尔马林浸泡石蜡包埋)样本的miRNA谱进行基因芯片检测。相关性分析显示血浆miRNA谱与肝脏谱具有较高的相关性(单个病例相关性r=0.26-0.57p=0.001-4.06×10-11,Pearson相关检验,11例总体相关性r=0.39,p<10-250)。如只考虑入选的11个miRNA,仍然能获得较显著的相关性(r=0.36,p=6.64×10-6)。这提示肝脏是血浆miRNA谱的主要来源,提示血浆miRNA谱可以间接反映肝miRNA的水平。鉴于上述工作发现血浆miRNA谱能用来预测慢乙肝患者干扰素治疗的初期病毒学应答,了解入选miRNA在乙肝病毒生活周期以及干扰素信号通路中的作用,本研究进一步通过体外实验评价了11种miRNA与HBV复制的关系。将miRNA类似物(mimic)或抑制剂(inhibitor)与HBV复制型质粒共转染Huh7细胞后发现,miR-939,miR-638与let-7f类似物能显著抑制HBV抗原表达。Southern Blot结果进一步证实病毒核心颗粒DNA合成也受到抑制。将miRNA与HBV RNA稳定性荧光素酶报告基因共转染发现,miR-939,miR-638与let-7f不能直接靶向HBV RNA序列。此外,本研究还通过将miRNA与干扰素诱生、效应通路报告载体共转染实验,发现这些miRNA并未显著影响相关信号的转导。通过转染miR-939,miR-638与let-7f,检测细胞基因表达谱差异发现这三种miRNA能下调大量宿主基因,其中部分与肿瘤形成、炎症因子信号传导相关。综上所述,本研究通过检测慢性乙型肝炎患者血浆miRNA谱,利用生物信息学方法优化获得一个由11个miRNA组成的可预测干扰素初期干扰素应答的模型,总体准确率达74.2%。进一步体外实验发现miR-939,miR-638与let-7f能抑制HBV复制,但并不靶向病毒RNA序列。我们的研究结果为进一步开发基于血浆miRNA的干扰素疗效预测试剂盒打下了基础,对入选miRNA的机制研究有助于了解感染慢性化过程中HBV与宿主相互调控的具体分子机制,有助于开发出新一代拮抗病毒复制药物提供分子靶标。