黄萎病菌是一种对植物危害性极大、传播性广的、无性的、土传性的半活体营养型病原真菌。黄萎病能够广泛引起植物叶片萎蔫,脱落等严重危害,已经对许多经济作物造成了巨大损失,其中,它又被称为棉花的“癌症”,所以研究植物抗黄萎病相关机制极为重要。本实验室前期研究表明,BIN2具有负调控棉花和拟南芥抗黄萎病的能力。茉莉酸（Jasmonate acid,JA）在植物响应黄萎病菌中起着至关重要的作用,同时也有研究表明BIN2可能和JAZ蛋白互作来调控植物抗黄萎病,但BIN2与JAZ之间分子机制以及BIN2如何调控JA信号通路尚不清晰。基于以上研究基础,本文以拟南芥BIN2负调控植物抗黄萎病为切入点,通过对拟南芥BIN2突变体中内源JA和Me JA含量的检测,我们发现功能获得型突变体bin2-1植株会导致JA和Me JA的显著积累,而功能缺失型突变体bin2-3bil1 bil2则会抑制JA和Me JA的产生,进一步验证了BIN2能够与JAZ蛋白家族互作。BIN2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,通过磷酸化底物并影响底物稳态而发挥作用。本论文通过体内磷酸化实验表明BIN2能够在植物体内磷酸化JAZ的T196,并通过26S泛素-蛋白酶体途径促进JAZ蛋白的降解,从而影响整个JA信号的传导。具体研究包括以下几个方面:1、BIN2突变体影响茉莉酸途径响应。从拟南芥BIN2突变体中检测JA和Me JA含量,结果表明bin2-3 bil1 bil2功能缺失型突变体抑制了JA和Me JA的产生,bin2-1功能获得型突变体则会导致JA和Me JA的显著积累。此外,我们检测了At BIN2突变体对Me JA处理的响应,从根长和鲜重的减少可以看出,功能获得型突变体bin2-1对JA信号的敏感性增强,而功能缺失型突变体bin2-3bil1 bil2则对JA的敏感性降低。这些研究结果表明,BIN2负调控植物对黄萎病的抗性可能是通过JA信号通路来实现的。2、BIN2与JA途径互作蛋白的验证。利用酵母双杂系统,验证BIN2能够与JAZ蛋白发生相互作用,进一步通过Bi FC实验证明了At BIN2与JA信号途径的负调控因子At JAZ1存在相互作用。截短实验证明,At BIN2与At JAZ1之间主要是通过ZIM结构域进行互作。3、在植物体内At BIN2磷酸化At JAZ1的T196并促进JAZ蛋白的降解。首先,原核诱导表达At JAZ1蛋白,将该蛋白与At BIN2过表达转基因植株中提取的总蛋白和野生型Col-0中提取的总蛋白分别孵育,发现JAZ1蛋白在At BIN2过表达转基因中降解加快。同时,利用At JAZ1的GUS染色报告系统,在Me JA和Bikinin的处理下,发现Me JA的处理可以促进JAZ1蛋白的降解,而Bikinin的处理显著提高At JAZ1转基因株系的GUS活性。此外,通过检测拟南芥BIN2突变体中At JAZ1蛋白量,发现BIN2功能缺失型突变体At JAZ1蛋白量增高,相反BIN2功能获得型突变体中At JAZ1蛋白量更少,进一步证实BIN2可以在体内促进JAZ1蛋白的降解。4、BIN2对JAZ1的磷酸化影响JA信号转导。利用Bikinin处理coi1-2突变体与Col-0,结果表明仅在Col-0中At JAZ1蛋白的表达量发生显著的积累。进一步利用体内LUC实验,并将PDF1.2的启动子荧光表达用于评估BIN2作用JA途径的影响,其中,MYC2蛋白负调控PDF1.2表达,而JAZ蛋白抑制MYC2蛋白的活性。结果显示,JAZ1-T196A、BIN2和MYC2对PDF1.2的LUC活性诱导作用更强。以上结果表明,BIN2在植物抗黄萎病的过程中,通过磷酸化JAZ蛋白促进JAZ蛋白降解从而激活茉莉酸途径,为BIN2调控JA之间的相互联系奠定了理论基础。