研究目的:以功能性多肽进行载体材料的表面修饰是目前药物递送领域的研究热点,其在促进载体的靶向性、细胞内吞、黏附的有效性以及对细胞内药物行为的影响已得到普遍认同。其中,多肽修饰的脂质体是较为成熟和研究最多的一种载体材料,在抗肿瘤药物和基因的递送领域具有重要地位。但多肽特别是小短肽在体内环境中容易被蛋白酶降解或从脂质体表面脱落,导致脂质体稳定性下降,多肽的功能难以发挥。有研究表明,多肽在脂质体表面的密度是影响其生物学活性的关键因素,合适的多肽表面密度通常意味着更好的载体稳定性和生物学效应。本课题拟通过三种方式:磷脂偶联法、胆固醇偶联法和直接嵌入法制备多肽修饰的脂质体,比较三种方法制备的脂质体稳定性,测定脂质体表面多肽密度,建立脂质体稳定性和多肽密度之间的关系。利用FRET原理,设计Cy5标记的多肽分子和罗丹明B（Rh B）标记的磷脂分子,通过测试Cy5和Rh B之间的FRET效率,判断多肽在脂质体表面是否成功嵌入,评价脂质体的脂质融合稳定性和血清稳定性。最终确定多肽修饰脂质体的最佳制备方法和最佳多肽表面密度,获得较高稳定性和较好传递性能的多肽修饰脂质体。研究方法:1.采用薄膜分散法制备脂质体,利用单因素法优化制备条件。借助DLS和TEM对脂质体进行粒径、形态考察,监测脂质体的储存稳定性。采用硫氰亚铁铵比色法对脂质体的磷脂含量进行测定。2.制备Cy5标记的三种多肽单体:RGDSK（Cy5）-PE（PPC）、RGDSK（Cy5）-chol（PCC）和C₁₈-（Cy5）KRGDS（LPC）和Rh B标记的磷脂单体:Rh B-PE（RBP）。采用薄层色谱法、红外光谱法和荧光光谱法对四种标记后的产物进行结构表征和荧光性能测试。3.改变多肽单体PPC、PCC和LPC的掺入量,采用三种方法:磷脂偶联法、胆固醇偶联法和直接嵌入法制备多肽修饰的脂质体。利用多肽上标记的cy5和磷脂上标记的Rh B之间FRET的效率判定多肽是否成功嵌入脂质体,通过荧光光谱法测定脂质体表面实际嵌入的多肽量。对多肽修饰的脂质体进行粒径检测。4.将不同多肽嵌入法和不同多肽表面密度的多肽修饰脂质体分别与空白脂质体和不同浓度的胎牛血清共同孵育,通过FRET效率的变化判断多肽的脱落率,确定多肽修饰脂质体的膜融合稳定性和血清稳定性,确定多肽修饰脂质体的最佳制备方法和最佳多肽表面密度。研究结果:1.制备的脂质体为单层囊泡,表面光滑,椭圆形,平均粒径为109±4 nm,PDI值为0.167,分散性良好。4℃下保存60 d后,粒径由108±4 nm变为113±3 nm,变化幅度不大,说明脂质体的储存稳定性良好。每100 mg脂质体中含有6.67 mg的磷脂。2.成功制备了Cy5标记的三种多肽单体PPC、PCC、LPC和Rh B标记的磷脂单体RBP。通过荧光光谱测试发现,RBP的最大发射波长与Rh B相比向长波移动6 nm。与Cy5相比,PPC的最大激发波长向短波移动约3 nm,PCC的最大发射波长向短波移动约4 nm,LPC的最大发射波长向短波移动约6 nm。标记后分子的荧光特性发生了变化,但变化情况各不相同。3.对不同嵌入方法及不同多肽加样量进行多肽嵌入率分析后发现,10 mol%LPC的多肽嵌入率最高,为7.56%,5 mol%PCC的多肽嵌入率最低,为2.94%。随着加入多肽加样量的增加,实际嵌入浓度也随之增加,其中直接嵌入法制备的多肽修饰脂质体嵌入率普遍较高。RBP与Cy5标记的多肽嵌入脂质体后,脂质体粒径较空白脂质体略有增加。4.在膜融合稳定性实验中,直接嵌入法制备的多肽修饰脂质体表现出比偶联磷脂法和偶联胆固醇法更优异的稳定性,偶联磷脂法的膜融合稳定性相对较差。另外,我们发现多肽配体实际的嵌入浓度越大,脂质体的稳定性越差。在血清稳定性实验中,三种嵌入法均表现出相对较好的稳定性,其中直接嵌入法的稳定性依然最好,血清的浓度对于脂质体的稳定性基本无影响。研究结论:本文研究表明,对于多肽修饰的脂质体,无论是多肽的嵌入方法还是多肽的实际嵌入密度,对脂质体的稳定性都有较大影响,通过脂肽的直接嵌入法得到的多肽修饰脂质体稳定性好于偶联磷脂法和偶联胆固醇法,而且,多肽的表面密度并不是越大越好,适当的多肽表面密度是维持脂质体稳定性需要考虑的重要因素。