论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科(Circoviridae)的圆环病毒属(Circovirus)成员,为单股负链闭合环状DNA病毒,基因组由1767~1768个核苷酸(nt)组成,病毒粒子为二十面体对称结构、无囊膜、直径约为17 nm,是已知的感染哺乳动物的最小病毒。PCV2主要感染猪,造成感染猪的免疫系统损害和抑制,引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD),继发或混合其他病原感染,给养猪业造成严重经济损失,是目前危害养猪业最为严重的病原之一。对PCV2致病机理的阐明是更好防控其对养猪业危害的基础,病毒编码产物功能的研究是揭示PCV2致病机理的重要方面。PCV2的基因组中包含多个潜在开放阅读框(Open reading frame,ORF),目前已有6个ORFs的编码产物被鉴定和进行了功能研究。其中,ORF5是本研究团队鉴定的PCV2的一个新的编码产物,研究发现ORF5蛋白具有引起宿主细胞周期阻滞、诱导细胞内质网应激反应和细胞自噬的作用。通过酵母双杂交技术筛选到多个与ORF5可能存在相互作用的宿主候选蛋白,14-3-3蛋白β/α(14-3-3 protein beta/alpha,YWHAB)是筛选到的受ORF5影响较为显著的蛋白之一。研究显示,宿主细胞YWHAB蛋白是一种多功能蛋白,在细胞内可以与数百种蛋白相互作用,在细胞周期调控、细胞凋亡以及细胞信号转导等细胞生物学进程中发挥重要作用。那么,宿主细胞YWHAB蛋白是否与ORF5蛋白存在相互作用?又在PCV2感染细胞中发挥什么作用?对PCV2复制有哪些影响?这些都是本研究所要解决的问题。为此,开展了YWHAB与PCV2 ORF5蛋白互作研究,YWHAB蛋白对PCV2复制的影响的研究。获得了以下结果。(1)宿主细胞YWHAB蛋白与PCV2 ORF5蛋白存在相互作用。通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)试验发现YWHAB蛋白与ORF5蛋白在细胞内存在相互作用,GST pull-down试验发现YWHAB蛋白与ORF5蛋白在细胞外存在相互作用,将表达YWHAB蛋白和ORF5蛋白的重组质粒转染细胞后,通过激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)观察到ORF5蛋白与YWHAB蛋白存在共定位现象。(2)PCV2感染及转染ORF5表达质粒的宿主细胞中YWHAB在转录水平(mRNA)和蛋白水平均出现上调。(3)YWHAB蛋白抑制PCV2在细胞中的复制。分别构建了过表达和干扰YWHAB蛋白的细胞株,感染PCV2后用RT-qPCR和Western blot的方法检测ORF5的转录以及Cap蛋白的转录和蛋白表达水平。结果显示,YWHAB抑制ORF5和Cap基因转录,Cap蛋白的表达也显著降低。结果表明,宿主细胞YWHAB蛋白对PCV2的复制具有抑制作用。(4)YWHAB蛋白抑制了由PCV2感染诱导的细胞内质网应激、自噬以及细胞凋亡。PCV2感染YWHAB过表达和干扰细胞株,RT-qPCR及Western blot检测发现,YWHAB蛋白下调了宿主细胞内质网应激反应标志蛋白GRP78和GRP94的转录和蛋白表达,抑制内质网应激反应;YWHAB下调了细胞自噬标志蛋白Beclin1的转录和LC3Ⅱ蛋白表达水平,抑制细胞自噬作用;流式细胞仪检测发现,YWHAB能够降低细胞的ROS水平,使细胞凋亡率降低。综上所述,宿主细胞YWHAB蛋白通过与PCV2 ORF5蛋白互作,抑制了PCV2感染细胞中内质网应激反应、细胞自噬作用、降低细胞内ROS水平和细胞凋亡作用,抑制了PCV2的复制。本研究为明确PCV2 ORF5蛋白在病毒感染中的作用,为PCV2致病机理的阐明提供了新的科学资料。