研究背景神经根型颈椎病（Cervical Radiculopathy,CR）是最常见的颈椎病类型,其颈神经根性疼痛是神经根型颈椎病患者的典型症状,其发生率显著高于运动功能障碍。中医认为该病属于“痹症”,由于“气血凝滞,久而成痹”产生“经脉闭阻,不通则痛”的临床表现。中药是治疗神经根型颈椎病常用的保守措施,中成药是中药基于现代工艺技术形成的分支,在临床应用广泛。颈痛颗粒作为专门治疗神经根型颈椎病的中成药,具有活血化瘀止痛的作用,临床疗效和安全性较好。但目前尚缺乏基于循证证据制订的专家共识以指导该药的临床应用,同时神经根型颈椎病的发病机制及颈痛颗粒的疗效机制有待深入探索,这些问题严重制约了颈痛颗粒在神经根型颈椎病临床治疗中的推广和应用。因此,我们对现有文献进行系统梳理,基于系统评价和GRADE分级开展相关的循证研究,以期发现目前存在的研究问题,为日后的研究提供思路;同时采用高通量蛋白质组学和分子生物学技术,探究本病在中枢神经和外周神经中的发病机制,并研究颈痛颗粒治疗的干预机制,旨在为中药防治神经根型颈椎病提供分子水平的科学证据。研究内容第一部分研究:基于GRADE分级系统的颈痛颗粒治疗神经根型颈椎病专家共识研究目的:基于循证证据制订颈痛颗粒的临床专家共识,以指导颈痛颗粒在神经根型颈椎病中的临床应用。方法:本共识以循证方法学为基础,采用国际公认的临床指南制定流程,首先通过说明书梳理、专家访谈、网络问卷调查和专家共识投票来确定共识的临床问题,随后制订规范的文献检索策略、纳入标准和排除标准,检索纳入颈痛颗粒治疗神经根型颈椎病的临床研究,并根据PICOS原则进行描述,其次基于Grade证据分级体系,采用Review Manager 5.4.1软件进行数据综合和偏倚风险评估,GRADEpro工具形成证据概要表,工作组形成推荐意见和专家共识条目后,再次通过专家名义组法投票确定最终的临床专家共识内容。结果:确认8个临床问题,形成5个推荐意见和3个专家共识。推荐意见分别为颈痛颗粒单独使用或联合其他疗法对于神经根型颈椎病具有较好的疗效,颈痛颗粒可单独使用,推荐意见为低级证据强推荐;颈痛颗粒可联合西药使用,推荐意见为极低证据强推荐;颈痛颗粒可联合外用药使用,推荐意见为极低证据强推荐;颈痛颗粒可联合非药物疗法,推荐意见为低证据强推荐。颈痛颗粒可单独使用治疗神经根型颈椎病术后患者,推荐意见为极低证据强推荐。建议的专家共识条目为颈痛颗粒可用于气滞血瘀证的相关患者,两周一为疗程,可用1-3疗程或酌情延长,且颈痛颗粒安全性较好。结论:颈痛颗粒治疗神经根型颈椎病具有较好疗效,推荐临床使用。第二部分研究:基于蛋白质组学联合WGCNA研究神经根型颈椎病的发病机制目的:通过高通量蛋白质组学探究并验证神经根型颈椎病在外周神经和中枢神经中的发病机制。方法:采用慢性背根神经节压迫构建神经根型颈椎病大鼠模型,完成机械痛觉过敏、热痛觉过敏和自发性疼痛等相关行为学评价后,对大鼠背根神经节、脊髓和脑脊液进行取材。采用尼氏染色评价正常神经元细胞数目,TUNEL染色评价神经元凋亡情况,将TMT标记定量蛋白质组学技术用于检测大鼠的背根神经节和脊髓组织,联合常规差异分析和WGCNA加权共表达网络分析对所得蛋白数据进行深入挖掘,通过GO、KEGG、GSEA等多角度进行生物功能分析。采用Western Blot检测、ELISA检测、双重免疫荧光染色、透射电子显微镜观察等技术验证和探索所获得的关键蛋白和关键发病过程。结果:模型组在术后疼痛相关的感觉功能障碍逐渐加重,模型组在术后第1天就表现出明显的刺痛觉过敏现象,模型组和假手术组的大鼠足底机械刺痛的作用力阈值相比较,从术后第1天开始一直到第14天的各个观察时点均存在显著统计学差异（P＜0.05）。模型组与假手术组大鼠比较,在术后第1天到第3天的各个观察时点两组大鼠足底热辐射痛阈值无统计学差异（P＞0.05）,在术后第7天到第14天的足底热辐射痛阈值存在统计学差异（P＜0.05）。模型组与假手术组大鼠比较,在术后第1天到第14天的各个观察时点两组自发性舔足次数存在统计学差异（P＜0.05）。尼氏体染色显示模型组神经组织明显存在损伤,脊髓后角中假手术组大鼠的正常神经元数目为40.75±7.676,明显多于模型组大鼠28.50±5.916（P＜0.05）;背根神经节中假手术组正常神经元数目为63.50±11.96,明显高于模型组数目45.75±2.217（P＜0.05）。TUNEL染色法检测显示模型组凋亡细胞显著增多,在脊髓背角中假手术组发生凋亡的细胞数目为23.38±3.68,模型组发生凋亡的细胞数目为30.96±3.41,两组间比较具有统计学差异（P＜0.05）;在背根神经节中假手术组凋亡细胞数目为21.49±5.88,模型组凋亡细胞数目为33.77±3.89,两组间比较具有统计学差异（P＜0.05）。TMT标记定量质谱检测提示检测结果分布符合理论情况,常规的数据差异性分析联合WGCNA找到造模手术干预后两种组织共有的潜在关键分子为2个上调的关键分子（Rpn2、Hmgb1）和5个下调的关键分子（Gdap1、Mtx2、Dnaja3、Hspa41、Sept3）。生物功能分析提示氧化应激和炎症免疫反应与该疾病相关。Western Blot检测最终验证出下调的GDAP1蛋白和上调HMGB1蛋白在两种组织中均存在显著变化。双重免疫荧光进一步证实GDAP1或HMGB1在背根神经节和脊髓的神经元细胞中表达存在差异。在抗氧化能力和线粒体形态变化的研究中,对背根神经节和脊髓中的SOD2和Catalase进行WB检测发现,背根神经节中模型组的Catalase蛋白要显著低于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;而在脊髓中模型组的SOD2蛋白表达显著低于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。我们对脊髓和背根神经节组织进行透射电镜观察,发现模型组中背根神经节和脊髓的神经元线粒体数目增加减少,线粒体嵴消失,甚至出现白色空泡,细胞出现水肿现象,少数可见细胞肿胀破裂等现象;神经节中的轴突可见脱髓鞘现象。在炎症相关通路的研究中,Western Blot检测发现背根神经节组织中,模型组的ERK1/2磷酸化激活程度显著高于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;模型组的NFKB1表达量显著高于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。在脊髓组织的结果与背根神经节类似,模型组的ERK1/2磷酸化激活程度也显著高于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;且模型组的NFKB1表达量显著高于假手术组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。对大鼠脑脊液进行ELISA检测。研究发现模型组脑脊液中的TNF-α和IL-1 β表达浓度均较假手术组高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:背根神经节和脊髓中的关键蛋白GDAP1和HMGB1,及其调控的抗氧化应激能力下降和炎症反应增加,可能是颈神经根病理性疼痛的外周（背根神经节）和中枢（脊髓）共有的关键发病机制。第三部分研究:颈痛颗粒治疗神经根型颈椎病的作用机制研究目的:探究颈痛颗粒能否调控神经根型颈椎病发病过程中的关键蛋白GDAP1和HMGB1,并减少神经元线粒体损伤、改善炎症微环境。方法:从80只雌性SD大鼠中选取72只依次编号,采用随机数字表法分为假手术（Sham）组、模型（Model）组、颈痛颗粒低浓度（JTKL-L）组、颈痛颗粒中浓度（JTKL-M）组、颈痛颗粒高浓度（JTKL-H）组和布洛芬（IBU）组,每组各12只,造模后第3天开始灌胃,共灌胃2周后处死所有大鼠,取脑脊液、背根神经节和脊髓。对大鼠进行机械痛觉过敏、热痛觉过敏和自发性疼痛等相关行为学评价。采用Western Blot检测、RT-PCR检测、ELISA检测、透射电子显微镜观察等技术探索和分析颈痛颗粒对关键分子GDAP1和HMGB1蛋白和mRNA表达的调控作用,并观察神经元线粒体损伤和炎症微环境的变化。结果:JTKL-H组大鼠在术后10、14、17天的足底机械刺痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,JTKL-M组大鼠在术后10、14、17天的足底机械刺痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,JTKL-L组大鼠在术后14、17天的足底机械刺痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,IBU组大鼠在术后14、17天的足底机械刺痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。JTKL-H组大鼠在术后10、14、17天的足底热辐射痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,JTKL-M组大鼠在术后第14、17天的足底热辐射痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。而JTKL-L组大鼠在术后第14、17天的足底热辐射痛阈值与Model组比较有无统计学差异（P＞0.05）,IBU组大鼠在术后17天的足底热辐射痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。JTKL-H组大鼠在术后10、14、17天的舔足次数与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,JTKL-M组大鼠在术后第14、17天的舔足次数与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。而JTKL-L组大鼠在术后第14、17天的舔足次数与Model组比较无统计学差异（P＞0.05）,IBU组大鼠在术后17天的舔足次数与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。在GDAP1蛋白表达的结果显示各组单因素方差分析的P值为0.001;其中Sham组显著高于其余5各组的表达值（P＜0.05）;JTKL-M 组表达量高于 Model 组（P＜0.05）。在 HMGB1的蛋白表达值结果显示各组单因素方差分析的P值小于0.0001;其中Sham组表达量低于Model组和IBU组（P＜0.05）;Model组表达值高于JTKL-L、JTKL-M、JTKL-H这3组（P＜0.05）;JTKL-L组表达值高于JTKL-M组和JTKL-H组（P＜0.05）;JTKL-M 组表达值低于 IBU 组（P＜0.05）;JTKL-H 组低于 IBU组（P＜0.05）。灌胃14天后对大鼠背根神经节组织的GDAP1和HMGB1的mRNA表达进行PCR检测。6组GDAP1 mRNA表达量的单因素方差分析P值=0.001;其中在 Model 组表达量明显低于 Sham、JTKL-M、JTKL-H 组（P＜0.05）。6组HMGB1 mRNA表达量的单因素方差分析P值=0.0054;其中Model组高于JTKL-M、JTKL-H（P＜0.05）。透射电镜结果显示JTKL-H组的细胞结构基本与JTKL-M组表现一致,线粒体结构基本正常,细胞损伤较轻。大鼠脑脊液中TNF-α和IL-1 β的ELISA检测显示,6组TNF-α表达量的单因素方差分析P值＜0.0001;其中在 Model 组表达量明显高于 Sham、JTKL-L、JTKL-M、JTKL-H 和IBU组（P＜0.05）;此外,IBU组和JTKL-L组比较有统计学差异（P＜0.05）。6组IL-1 β表达量的单因素方差分析P值=0.0001;其中Sham组的表达量低于Model、JTKL-L 和 IBU 组（P＜0.05）;Model组高于 JTKL-M、JTKL-H（P＜0.05）。结论:在神经根型颈椎病大鼠模型中,颈痛颗粒的中高浓度被发现能显著减少机械性疼痛过敏、热痛觉过敏和自发性疼痛,同时颈痛颗粒可增加背根神经节中GDAP1蛋白和mRNA表达,减少HMGB1的蛋白和mRNA表达,抑制炎症因子分泌,减少背根神经节中神经元细胞的线粒体结构损伤,起到保护神经元细胞损伤的作用。