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燕麦向光素的LOV(Light,Oxygen,Voltage)结构域包含LOV1和LOV2两个亚基。其中LOV2结构域作为荧光蛋白,相比于绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP),具有自身独特的优点:1、LOV2结构域蛋白是可溶性的;2、它的相对分子质量小,大约只有100-140个氨基酸残基;3、它的光吸收辅助因子-黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FMN)几乎存在于所有类型的细胞中;4、相同条件下,其荧光强度显著强于绿色荧光蛋白。正是由于这些优点使其成为了光遗传学研究的理想工具,广泛地被应用于医学和生命科学的研究中。 本论文主要包括以下三个部分的工作: 1.本研究根据Genebank中的燕麦向光素基因序列,人工合成了LOV2结构域编码的基因片段:AsLOV2(404-560);并构建C450A突变基因,AsLOV2(404-560,C450A);进一步缺失C末端的Jα肽段,得到AsLOV2(404-521,C450A)。这三个基因片段被克隆于表达载体pGEX-6p-1,利用亲和层析的方法,纯化得到与gst标签融合的目标蛋白。结果表明三种纯化蛋白具有与参考文献一致的吸收光谱,且三种蛋白均可与FMN结合,并表现出光活性。在荧光强度方面,突变蛋白的荧光强度大约是野生型的6倍,突变截短型蛋白的荧光强度大约是野生型的7倍。在此前提下,本研究还构建表达了AsLOV2(404-521,C450A)与细胞色素b562(cytochrome b562, cytb562)的融合蛋白,即cytb562-3c-AsLOV2(404-521,C450A)和AsLOV2(404-521,C450A)-3c-cytb562。3c蛋白酶(PreScission protease)具有特异性识别融合蛋白连接肽段的作用,用其对融合蛋白进行酶切。结果表明:聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示融合蛋白被3c蛋白酶切割开,但是融合蛋白的荧光强度并未如预期的那样显著增强。 2.本研究还将野生型AsLOV2结构域中半胱氨酸周围的一些氨基酸均突变为半胱氨酸,并构建了N449C、R451C、Q446C、I428C、F429C、A430C等突变。在有Hg2+存在的条件下,野生型AsLOV2中的半胱氨酸巯基与Hg2+结合而不与FMN发生加成反应,从而使荧光增强,实现对Hg2+的荧光检测。结果表明:这些突变蛋白和野生型一样,均未实现对Hg2+有明显荧光增强的响应效应,其中F429C突变蛋白加入Hg2+后,荧光强度略有升高。 3.本论文还研究了胆绿素(biliverdin,BV)与不同结构DNA的相互作用,发现BV能选择性地与平行结构的G-四链体(G-quadruplex)结合,表现出明显的增色效应,并在740 nm处产生新的吸收峰。根据Job plot曲线显示,BV与G-quadruplex以1∶1的比例结合,但二者的复合物没有荧光产生。