四重霉素(Quartromicins)是从东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalisNo.4427-8中分离到的一系列具有良好抗病毒活性的螺乙酰乙酸内酯类天然产物。它们具有全碳的32元大环骨架，包含由不饱和碳链邻接的四个螺乙酰乙酸内酯结构单元。相邻螺乙酰乙酸内酯单元的立体构型相异而相对的立体构型相同，使得整个分子呈C-2对称。本文针对四重霉素的生物合成展开了研究，以期阐述四重霉素骨架构建相关的一些独特而新颖的酶催化途径。　　本课题组已经成功获得了四重霉素的生物合成基因簇，并阐释了四重霉素构建所需的长短两条聚酮链由一套PKS蛋白通过“链跳跃”的机制负责形成。在此基础上，我阐明了螺乙酰乙酸内酯家族化合物生物合成中通用的乙酰化/消除策略来构建环外双键。我首先设计了酶活性测试所需底物的合成路线，并顺利获得了底物104和105。通过生物信息学比对分析，猜测在所有螺乙酰乙酸内酯家族化合物基因簇内均严格保守的QmnD3和QmnD4可能负责104和105的脱水。体外生化实验证实了脱水采用了“乙酰化/消除”机制:酰基转移酶QmnD3先对底物104和105的羟基分别进行乙酰化得到Ac-104和Ac-105，α/β水解酶家族蛋白QmnD4对Ac-104和Ac-105进行脱乙酸形成后续[4+2]反应的前体106和107。酶反应动力学显示乙酰辅酶A可能为QmnD3的真实酰基供体，定点突变实验验证了QmnD3保守的H227xxxD231基序对其活性至关重要。QmnD4代表了一类新型的具有烯醇化能力的α/β水解酶家族蛋白。通过对它的深入研究，我们提出了其催化脱乙酸的可能“二元催化位点”机制。　　接着，我对螺乙酰乙酸内酯结构单元的生物合成机制进行了探索，并成功构建了后续研究所需的异源表达喂养体系。首先对11个候选基因进行了系统的蛋白表达纯化，获得了QmnF、QmnH、QmnI、QmnK和QmnM共5个可溶性蛋白。使用104和105作为酶反应底物，加入得到的5个蛋白并串联QmnD3和QmnD4在体外进行了“一锅法”测活，但是没有检测到任何新的产物。转而进行异源表达喂养实验，通过黏粒改造和基因拼接的方法得到了两个异源表达质粒8-18-5和pIB-All，分别将它们导入链霉菌S.lividans1326并进行了底物104和105的喂养。在S.lividans-8-18-5喂养体系中检测到了一个新的化合物，根据质谱信息推测其可能为发生了一步[4+2]环加成反应的中间体。同时大肠杆菌异源喂养的可行性也得到了初步验证。这为后续有关四重霉素四个螺乙酰乙酸内酯环的组装机制研究奠定了基础。